[发明专利]一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法

说明书

技术领域

本发明涉及农业生物工程领域中一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法。

背景技术

异黄酮是豆类植物体内形成的一类次生代谢产物，它主要参与组织和病源微生物的互作及防御反应(谢明杰等，2004；孙君明等，2005；Subramanian等.2005；马君兰等，2007；王海涛等，2009)。大豆富含异黄酮，其种子中异黄酮主要由12种化合物单体组成：9种异黄酮糖苷(Daidzin、Glycitin、Genistin、Malonyldaidzin、Malonylglycitin、Malonylgenistin、Acetyldaidzin、Acetylglycitin和Acetylgenistin)和3种配糖体(Daidzein、Glycitein和Genistein)(孙君明等，1995)。其中，Genistin(染料木苷)和Daidzin(黄豆苷)这2种组分占大豆异黄酮总量的95％以上(张永忠和李文滨，2005)。由于大豆异黄酮各单体的最大吸收波长接近，且吸光度又具有加和性，所以，大豆异黄酮的总含量可用紫外分光光度计法来测定。

异黄酮类物质是由苯丙烷类代谢途径的一个分支所合成，其合成前体是苯丙氨酸和丙二酰辅酶A，经苯丙氨酸裂解酶(PAL)，香豆酸辅酶A连接酶(4CL)，查尔酮合成酶(CHS)，查尔酮异构酶(CHI),异黄酮合成酶(IFS)等酶催化，形成不同的异黄酮类物质。苯丙氨酸解氨酶PAL是联系植物初级代谢和次级代谢的关键酶，是苯丙烷类代谢途径的第一个关键酶，而异黄酮合酶(IFS)是进入异黄酮合成途径的第一个酶，是形成异黄酮类物质的关键代谢酶。苯丙氨酸解氨酶(PAL)、查尔酮合成酶(CHS)、异黄酮合成酶(IFS)都是异黄酮合成途径的关键酶(马君兰等，2007)，能够在转录和转录后水平对异黄酮的生物合成进行调控。

在异黄酮合成途径及其调控机理的研究方面，为了抑制异黄酮的生物合成，目前多采用外加代谢抑制剂阻断法(Srinivasan等，1996；李贺勤等，2009)。这些抑制剂包括蛋白激酶抑制剂K252a、磷脂酶A2抑制剂花生四烯酸ETYA，线粒体ATPase合成的抑制剂二环己基碳二亚胺(DCCD)、寡霉素(Oligomycin)和解耦联剂羰基氰对三氟基苯腙(FCCP)等(刘文奇和郭泽建，2003)。李贺勤等(2009)用苯丙氨酸解氨酶的专性抑制剂α-氨氧乙酸(AOA)显著抑制了野葛细胞悬浮物的异黄酮合成。王敬文等(1981)用放线菌素D和环己酰胺等PAL抑制剂处理甘薯后几个小时内就检测到了PAL酶活性的降低及下游代谢产物合成积累的受阻。这种利用化学物质抑制异黄酮生物合成的方法虽然有效，但费用较高，且对植物细胞的其他代谢过程具有潜在的不利影响。也有报道采用RNA干扰技术来降低大豆异黄酮含量，以研究大豆组织异黄酮含量与其对Phytophthora sojae菌敏感性的关系(Subramanian等，2005；Graham等，2007)，但这种方法需要复杂的基因克隆、载体构建和遗传转化等过程。

发明内容

本发明的目的就是为了克服上述技术的缺陷，提供一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，为研究大豆组织异黄酮含量与其对病源微生物防御反应的关系提供一种新途径，也为揭示大豆遗传转化机理研究奠定基础。本发明的原理是通过对大豆组织进行超声处理，干扰大豆异黄酮生物合成途径中关键酶基因的表达并降低其酶活性，最终减少大豆异黄酮类物质的合成和积累。

本发明提供了一种利用超声处理抑制大豆异黄酮生物合成的方法，其特征在于包括如下步骤：

①种子的消毒：取健康饱满大豆种子，放入含有100ml30％次氯酸钠和4ml浓盐酸的密闭容器内，利用反应生成的氯气消毒24～36h；

②种子的萌发培养：将步骤①中的种子接种到B5培养基中进行为期5～6天的25℃、16/8h光暗周期的培养；

③大豆子叶外植体制备：将步骤②中的种子在无菌条件下去掉种皮、切掉幼叶和上胚轴，保留0.2～0.3cm的下胚轴；

④超声处理：将步骤③中的外植体放到含有75ml营养液的150ml容量的三角瓶中，并置于超声器中，在40KHZ、20℃～25℃条件下超声处理3min；

⑤外植体培养：将步骤④中超声处理过的外植体用灭菌滤纸吸掉多余水分，摆放到B5培养基上，25℃下暗培养1～3天；

⑥分别测定步骤⑤外植体的异黄酮合成途径中关键酶基因相对表达量、PAL活性和异黄酮合成积累量。