[发明专利]用于检测哺乳动物囊胚ICM/TE比值和细胞凋亡的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及细胞生物学领域及免疫荧光技术，具体地说，涉及一种用于检测哺乳动物囊胚ICM/TE比值和细胞凋亡的试剂盒。 

背景技术

随着胚胎生物技术研究的不断拓展和深入，无论是体外生产胚胎，胚胎的显微操作还是胚胎移植，在提高胚胎数量的同时，胚胎的质量也越来越成为研究的热点。囊胚细胞分为内细胞团细胞(inner cell mass,ICM)和滋养层细胞(trophectoderm，TE)，二者的比值(ICM/TE)或内细胞团细胞与囊胚细胞总数(total cell number，TCN)的比值(ICM/TCN)能科学地衡量胚胎的质量。差异染色是一种细胞计数方法，能清晰地区分上述两种细胞。然而传统的差异染色方法存在准确率低，重复性差，图片不够清晰等缺点。 

囊胚细胞的凋亡程度是评判胚胎质量的另一重要指标，一般常用TUNEL方法检测细胞凋亡。在胚胎的质量评定过程中，常需要对ICM/TE和细胞凋亡同时进行检测分析，这使得检测所需的胚胎数量增加到原来的两倍；而且，不能达到在同一个胚胎中同时进行ICM/TE和凋亡检测的目的，即一个胚胎不能反应两个层面的信息，因而无法探测其内在的联系。因此如何提高囊胚质量检测的效率，并充分地、多方位地体现胚胎发育的内在规律，成为动物胚胎研究的重点和焦点。 

体内囊胚的TE随胚胎发育显著增多，ICM发育增多却并不显著，ICM/TE呈显著下降，说明在囊胚发育的各个时期TE增殖比ICM快。Willadsen等研究认为，ICM比例的降低表现出发育能力的下降。因此，ICM/TE可以反映出囊胚质量的优劣。 

为计算囊胚的ICM/TE比值，需先对ICM和TE分别染色，然后再计数。目前常用的染色方法有两种，补体法和简易染色法。补体法的原理是采用补体与处于囊胚外层的TE表面的抗原及添加的抗体结合后，使得TE细胞膜溶解破坏，然后碘化丙啶(propidium iodide，PI)进入TE内与其DNA结合，在显微镜下观察为红色荧光。另一染料Hoest33342能进入囊胚的所有细胞与DNA结合，显微镜下观察为蓝色荧光，两种颜色叠加后为粉红色荧光，即为TE，蓝色的则为ICM。孟令君等应用该法对小鼠囊胚进行了染色，发现抗血清的稀释度和作用时间、豚鼠补体的稀释度和PI的染色时间均会影响囊胚ICM或TE的计数，因而需要对染色条件进行优化。Machaty等采用该法对两种培养体系获得的猪体内和体外胚胎进行了质量鉴定。仓明等也利用该法对牛体外受精囊胚的质量进行评价，表明抗血清的最低稀释度为1:5。总之，从形态上看似相似的囊胚经过同样的差异染色处理后结果不同，ICM和TE的细胞数不同，清晰度不同,对染料的接受度也略有不同。 

简易染色法则首先由Thouas等建立，即使用Triton X-100代替补体来增加TE细胞膜的通透性，Triton X-100是一种非离子型表面活性剂(或称去污剂)，能溶解脂质，以增加大分子染料对细胞膜的通透性。对小鼠和牛囊胚，该方法均能有效计数TE和ICM细胞，可作为补体法的替代，缩短了染色时间，降低了染色成本。李瑞歧等采用该法也对牛、羊的囊胚进行了质量分析，结果随着Triton X-100处理时间的延长，PI进入的细胞数目逐渐增加，因此对于不同的动物品种、囊胚大小与细胞总数，Triton X-100处理的时间和染料作用时间不同，因而使用简易差染法必须注意胚胎发育时期的一致性，对于不同发育阶段的胚胎，其细胞数不同。 

近来研究表明，CDX2蛋白只在囊胚TE细胞表达，因而CDX2被认为是TE细胞的标记物。细胞凋亡的检测方法则是TUNEL法，主要 是利用DNA断裂产生的3’-OH末端可与地高辛结合，地高辛可与过氧化物酶结合，利用适当底物，过氧化物酶会产生颜色反应，最后通过显微镜可以定位并观察凋亡细胞。刘霞等采用此法对体外受精的牛囊胚细胞进行了凋亡检测，获得的结果可靠，图片清晰。对细胞凋亡的研究表明，半胱氨酸蛋白酶家族(cysteineproteaseP-3，caspase)是细胞凋亡过程中的关键元件，其激活与超常表达均引起细胞凋亡，因此又称死亡蛋白酶，可通过与众多蛋白因子的相互作用调控细胞凋亡。在已发现的14个家族成员中，Caspase-3处于凋亡有序级联反应的下游，是最重要的效应型Caspase，是Caspase家族中的最重要的凋亡执行者之一，是细胞凋亡的关键执行者，是细胞凋亡过程中的主要效应因子，因此Caspase-3常被用作细胞凋亡检测的标志物。