[发明专利]用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段及其制备方法

权利要求书

1.用于天然彩色新品种蚕鉴定的丝蛋白肽段，其特征在于，其基因序列包括家蚕丝H链非结晶区基因、H链结晶区与非结晶区的重组基因以及天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链基因片段。

2.根据权利要求1所述的丝蛋白肽段，其特征在于，所述的家蚕丝H链非结晶区基因构建的表达载体为pGEX-F(1)，所述的H链结晶区与非结晶区的重组基因构建的表达载体为pGEX-gs16f1，所述的天然彩色茧蚕柞蚕、天蚕蚕丝H链基因片段的表达载体为pGEX-AYR4。

3.一种制备如权利要求1或2所述的丝蛋白肽段的方法，其特征在于，包括家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，家蚕品种蚕丝结晶区与非结晶区重组基因的克隆、表达载体构建与表达，天然彩色茧品种蚕丝基因的克隆、表达载体构建与表达。

4.如权利要求3所述的丝蛋白肽段的制备方法，其特征在于，所述的家蚕品种蚕丝非结晶区基因的克隆、表达载体构建与表达，包括以下步骤：

A、对Invitrogen公司合成的家蚕品种蚕丝非结晶区基因的非重复序列肽段F(1)的编码基因序列，基因序列的一端设计有限制性核酸内切酶HindIII-NgoMIV位点，另一端设计有AgeI-BglII位点，用已经保存的含多克隆位点的基础质粒来完成非结晶区基因序列的克隆，用限制性核酸内切酶BglII/HindIII消化pSLFA1180FA，插入设计合成的含有BglII和HindIII的粘末端非结晶区基因序列，T4DNA连接酶连接后得到含有完整非结晶区编码基因的质粒pSL-F(1)；

B、由pGEX-KG经过改造加入限制性核酸内切酶AgeI位点得pGEX-AgeI，AgeI/HindIII酶切的pGEX-AgeI载体回收载体片段，AgeI/HindIII酶切质粒回收插入片段，T4DNA连接酶连接构建含有非结晶区肽段基因的表达载体表示为pGEX-F(1)；

C、将构建的表达载体pGEX-F(1)转入大肠杆菌BL21菌细胞，加入0-1.2mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳苷糖(IPTG)，在37度转速200rpm/min的空气摇床中诱导培养0-8小时，然后用4100rpm/min的速度离心收集表达GST融合蛋白的BL21菌细胞；

D、菌细胞用适量的磷酸盐缓冲液重悬，置于冰上超声破碎后13300r/min的速度离心10min，收集上清液；

E、将超声破碎后收集的上清液用GST亲和层析柱纯化，获得了纯度较高的融合蛋白GST-F(1)；

F、采用葡聚糖G-50分子筛去除GST亲和层析过程中的还原型谷胱甘肽后，融合蛋白经凝血酶酶切，再经GST亲和层析柱纯化获得设计所需要的源于家蚕蚕丝蛋白的多肽F(1)。