[发明专利]一种检测活体植物细胞中两种膜蛋白共定位程度的方法

权利要求书

1.一种检测活体植物细胞中两种膜蛋白共定位程度的方法，包括如下步骤：

(1)使植物中共表达如下两种融合蛋白，以获得对待测两种蛋白进行了双色标记的植物材料：荧光蛋白A标记的待测蛋白A，荧光蛋白B标记的待测蛋白B，荧光蛋白A与荧光蛋白B发不同颜色的荧光；

(2)用可变角全内反射荧光显微镜对待测植物材料进行观察，获得双通道图像；

(3)用ImageJ软件将所得双通道图像保存为无损压缩的TIFF格式，然后在PPA软件中对两个图像进行校准，再用中值滤波对图像进行去背景处理，最后通过双高斯拟合计算待测蛋白A和待测蛋白B的接近指数，从而得到待测蛋白A和待测蛋白B的共定位程度。

2.根据权利1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述荧光蛋白A和荧光蛋白B为绿色荧光蛋白GFP或红色荧光蛋白mCherry。

3.根据权利1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述待测蛋白A和待测蛋白B为拟南芥向光素phot1或网格蛋白轻链clathrin轻链CLC。

4.根据权利1-3任一所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述植物为拟南芥。

5.根据权利1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述观察过程中，检测绿色荧光蛋白标记的待测蛋白使用的激发波长为473nm或488nm，检测红色荧光蛋白标记的待测蛋白使用的激发波长为543nm或561nm。

6.根据权利1-4任一所述的方法，其特征在于，步骤(2)中，所述观察过程中，曝光时间为100ms或200ms；

和/或，步骤(2)中，所述待测植物材料为活体植物材料，所述活体植物材料具体为植物幼苗胚轴或植物幼苗的根或植物幼苗的叶片。

7.根据权利1-6任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，用ImageJ软件将所得双通道图像保存为无损压缩的TIFF格式的方法为：在ImageJ软件中打开所述双通道图像，通过Image->Type将图像转化为16-bit，点击Edit->Options->Input/Output…，设置JPEG Quality(1-100)为100，然后将两张图像均另存为TIFF格式。

8.根据权利1-7任一所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，在PPA软件中对两个图像进行校准的方法为：在PPA软件中打开所述无损压缩的TIFF格式图像，点击Show->Images确定两张图像对应的编号Image1和Image2；运行Analyze->Alignment后，返回的信息将会有两种；如果返回信息为“No shift needed”，即图像不需要进行校准，点击“OK”即可完成图像校准；如果返回信息为“Max correlation is at(X,Y),shift the image pair？”，则要根据X和Y的值来判断是否进行校准，当X和Y的绝对值均小于50时，进行校正，点击“是”；当X和Y的绝对值大于50时，则两张图像焦平面可能没有重合，不适合进行共定位程度的计算，这个时候需要更换一组图像再进行计算。

9.根据权利1-8任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述用中值滤波对图像进行去背景处理的方法为：在PPA软件中，运行Analyze->Median Filter，确定弹出的对话框中两个选项都被选中；“Large Square Size”设置为16或32，“Small Square Size”设置为2或3；点击“OK”，完成去背景处理。

10.根据权利1-9任一所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述通过双高斯拟合计算待测蛋白A和待测蛋白B的共定位程度的方法为：

在PPA软件中，运行Analyze->Correlation->Cross-correlation，在弹出的界面中，点击“Contour”使互相关曲线以等值线图的形式展示，再点击“Enter Draw Mode”，在等值线图中沿缓峰绘制一条通过原点的直线，点击鼠标右键，选择“Shift to zero”。然后选中“Autocorrelation1”，点击“Fit”；再选中“Autocorrelation2”，点击“Fit”；最后选中“Crosscorrelation”，点击“Fit”，双高斯拟合返回的数值PPI1和PPI2分别为Image1和Image2所对应的蛋白接近指数值；点击File->Add Current Result，然后运行Show->Result，即可看到所有参数和结果。