[发明专利]基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法

权利要求书

1.一种基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，其特征在于：利用反向遗传学技术拯救出具有融合表达增强型绿色荧光蛋白的狂犬病弱毒株rRV-eGFP，将该毒株与56℃30min灭活的待检血清37℃作用一小时后，接种到BHK-21细胞上，48小时后直接在荧光显微镜观察结果。

2.根据权利要求1所述的基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，其特征在于：利用两倍系列稀释的预灭活的犬或人血清与等体积的100TCID₅₀的rRV-eGFP株混匀，于37℃5％CO₂作用1小时后接种到约2×10⁴个BHK-21的96孔板中，于37℃5％CO₂培养箱培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。

3.根据权利要求2所述的基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)血清的准备

将待检测和OIE标准血清于56℃水浴作用30分钟，取100μL犬或人血清按两倍系列稀释；

(2)血清与重组病毒相互作用

分别取50μL系列稀释好的血清于灭菌离心管中，每个稀释度设3个重复，每管加入等体积100TCID₅₀的重组病毒液，混匀，于37℃培养箱作用1小时；

(3)取上述处理的100μL血清与病毒混合液加入到事先培养成2×10⁴个BHK-21细胞的96孔板中，于37℃5％CO₂孵育1小时，吸出血清与病毒混合液，加入含2％胎牛血清的DMEM，于37℃5％CO₂温湿培养箱中培养48小时，直接在倒置荧光显微镜下观察有无绿色荧光。

4.一种狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)重组狂犬病病毒rRV-eGFP的感染性cDNA构建

利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合，具体操作过程按以下步骤进行：

以prRC-HL(+)质粒为模板分别扩增出P-1基因和M-2基因部分，以peGFP-N1质粒为模板扩增出eGFP部分，利用重叠PCR将这三段基因融合扩增在一起，命名为P+eGFP，克隆到pMD18-T载体中，随后利用酶切位点Spe I和SacⅡ将融合的P+eGFP基因片段置换到prRC-HL(+)质粒中，得到重组质粒pRV-eGFP；

(2)制备拯救重组病毒rRV-eGFP

于24孔细胞培养板培养BSR-T7细胞至70％单层，约为1×10⁵个细胞时，吸出培养液，用无血清的Opti-MEM(1×)洗涤细胞两次，然后加入室温已静置20分钟的混合转染试剂：2μg pRV-eGFP、0.4μg p-N、0.1μg p-P、0.2μg p-L和3μL的脂质体混匀物，4小时后吸出转染试剂加入5％胎牛血清培养基，3天后补加200μL的维持液，5天后收获病毒。

5.根据权利要求4所述的狂犬病弱毒株rRV-eGFP的制备方法，其特征在于：所述扩增的引物具有以下碱基序列：

P-F：5'-tcaacccagatcactagtcaagagcc-3'，

P-R：5'-catggtggcgctagcgcaagatgcatagcgat-3'；

eGFP-F:5'-gcatcttgcgctagcgccaccatggtgagcaag-3'，

eGFP-R：5'-agttcggagcggccgcttacttgtacagctcgt-3'；

M-F：5'-caagtaagcggccgctccgaactcttaaactcag-3'，

M-R：5'-caagtgatgagcccgcgggatatagt-3'。

6.P+eGFP融合基因，其特征在于具有序列表SEQ.ID.No.1的碱基序列。

7.权利要求1所述P+eGFP融合基因在制备基于拯救重组狂犬病弱毒的新型中和抗体检测试剂盒方面的应用。

8.权利要求1所述P+eGFP融合基因的制备方法，其特征在于利用反向遗传学技术，将eGFP基因与狂犬病病毒弱毒株RC-HL的感染性cDNA的P基因融合。