[发明专利]基于DNA条形码的鉴别金钱白花蛇的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及中药的品种鉴定技术领域，具体涉及一种鉴别金钱白花蛇及其伪品的引物及PCR-RFLP方法和试剂盒。

背景技术

金钱白花蛇为眼镜蛇科动物银环蛇(Bungarus multicinctus)的幼蛇干燥体。气微腥，味微咸。具有祛风、通络、止痉的功效。用于风湿顽痹、麻木拘挛、中风口眼斜、半身不遂、抽搐、破伤风、麻风、疥癣等。金钱白花蛇市场称作小白花蛇，是一味常用名贵中药材，但随着生态环境的恶化及金钱白花蛇产量较低，导致其药材资源急剧减少。由于疗效显著、药源紧张，金钱白花蛇价格节节攀升，并使得金钱白花蛇市场充斥各种伪品，常见伪品有赤链蛇、金环蛇、铅色水蛇等。并难以根据形态学上的特征进行单一鉴别，使得品种的鉴定越来越困难。因此寻找快速、准确的方法鉴别金钱白花蛇是药材鉴定中的一个重要问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种准确鉴别金钱白花蛇的PCR-RFLP分子鉴定方法，包括金钱白花蛇的特征DNA碱基序列、一对PCR引物、限制性内切酶酶切位点、鉴定方法及其试剂盒。

本发明基于DNA条形码。DNA条形码(DNA barcoding)是利用一个或少数几个DNA片段对物种进行识别和鉴定的一项新技术。2003年Herbert等选取线粒体细胞色素C氧化酶亚基I的一段序列在动物界不同分类水平上(门、目、种)进行分析，发现无论在哪个分类水平上该基因都具有良好的识别能力，从而提出建立以一段长度为650bp的COI基因序列为基础的条形码识别方法。随后的研究表明，COI(线粒体细胞色素氧化酶亚基I)基因序列种内变异小，种间变异大，且其DNA序列本身很少存在插入和缺失，对动物物种的识别和鉴定切实可行，被公认为动物界中标准的DNA条形码基因。

本发明的技术方案如下：首先从各样本中提取总DNA，利用引物DK1-CO1及DK1-CO2，用PCR方法扩增COI片段，经纯化后，对该片段进行DNA序列测定，将所得序列登录到Genbank系统获得登录号，并建立各样品的DNA序列数据库；在比较数据库DNA序列的基础上，得到金钱白花蛇的特征DNA碱基序列：5’-ACTAGT-3’(位于COI序列第121位至126位)，该序列可被限制性内切酶Spe I识别并切割；然而该特征DNA序列并非金钱白花蛇所特有，在乌梢蛇的COI序列中也存在该特征序列，为了有效区分金钱白花蛇与乌梢蛇，本发明增加选定金钱白花蛇的另一特征DNA序列5’-GGTAACC-3’(位于COI序列第353位至359位)，在乌梢蛇的相同位点出现的是5’-GGAAACC-3’，仅有金钱白花蛇的特征序列可被限制性内切酶BstE II识别并切割；序列5’-ACTAGT-3’与序列5’-GGTAACC-3’共同组成金钱白花蛇的特征DNA序列，利用能够识别并切割金钱白花蛇特征DNA序列的限制性内切酶Spe I和BstE II共同对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱，通过分析上述双酶切图谱差异，达到快速、准确鉴别金钱白花蛇的目的。

对需要鉴定的金钱白花蛇样品，提取其DNA，在给定的PCR条件下，用一对引物(DK1-CO1、DK1-CO2)扩增，供试品能够扩增出一段DNA片段；用限制性内切酶Spe I及BstE II对供试品的PCR扩增产物进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳检测，金钱白花蛇会出现分子量为121bp、232bp和305bp的三条DNA片段，而其它种类的蛇不出现上述三条片段或少于三条片段。当供试品经本法进行PCR扩增，并对PCR产物进行限制性内切酶双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段的大小，便可准确鉴定供试品是否为金钱白花蛇。

本发明提出的用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP方法的PCR扩增引物，其引物序列为：

DK1-CO1：5’-CAACTAACCACAAAGACATCGG-3’；

DK1-CO2：5’-CTTCTGGGTGGCCGAAAAATCA-3’。

本发明用于鉴别金钱白花蛇PCR-RFLP分子鉴定方法，利用能够分别识别金钱白花蛇特征DNA碱基序列5’-ACTAGT-3’和5’-GGTAACC-3’的限制性内切酶Spe I和BstE II，对纯化后的PCR产物进行消化，产生琼脂糖凝胶电泳的特征图谱；具体步骤如下：

1)提取待测样品DNA；

2)扩增DNA片段，PCR反应参数包括：93℃预变性5min，55℃2min；93℃变性30s，55℃复性45s，70℃延伸45s，35个循环；70℃延伸5min。所述引物DK1-CO1和DK1-CO2，其序列为：