[发明专利]一种尿同型胱氨酸快速测定方法

说明书

 

技术领域

 本发明涉及一种检测方法，具体涉及一种快速检测尿同型胱氨酸的方法。

背景技术

总同型胱氨酸（Total Homocystine, tHcy）包括同型胱氨酸和血浆中的双硫衍生物。tHcy的正常水平是<15μmol/l。同型半胱氨酸是蛋氨酸降解的中间代谢物，正常情况下它可以再甲基再生成蛋氨酸。正常人的血和尿液中一般检测不到同型半胱氨酸。如果胱硫醚合成酶（Cystationine β-synthase, CBS）或/和5-10-甲烯四氢叶酸还原酶（5,10-methylene-tetrahydrofolate reductase, MTHFR）缺乏，就会引起同型半胱氨酸及其硫醚衍生物在体内聚集。测定尿同型胱氨酸就可以了解体内同型胱氨酸的存在水平。

尿同型胱氨酸测定目前使用的方法是硝普钠试验：尿液1ml加入5%氰化钠水溶液，放置5分钟，加入5%硝普钠水溶液一滴，出现红色或紫红色为阳性，表示尿中有过量的含硫氨基酸。该法涉及剧毒物质---氰化钠，生物安全度极低，给生产和使用均造成极大隐患。因此，发明一种安全无毒、操作简单、成本低廉的检测方法及检测装置快速的确定尿液中是否含有同型胱氨酸，成为一个亟需解决的问题。

发明内容

为了解决现有技术中检测尿液中的同型胱氨酸方法毒性高、生物安全度低的问题，本发明提供了新的尿同型胱氨酸快速测定方法，本发明提供的方法其生物安全度高，而且灵敏度高，成本低廉，方便快捷。

本发明提供的快速检测尿液中同型胱氨酸的方法，包括以下检测步骤：

在测试孔内顺序加入试剂A100μl、尿液50μl、试剂B50μl 和试剂C50μl，在对照孔内顺序加入试剂A100μl、尿液50μl、试剂D50μl、试剂B50μl 和试剂C 50μl；  2分钟内观察两孔颜色变化，若测试孔显蓝色、对照孔未显色或测试孔显色明显重于对照孔则为阳性，表明尿标本内含有同型胱氨酸；若两孔均未显色或显色无明显差异则为阴性，表明尿标本内不含有同型胱氨酸；

所述试剂A为2M PH5.0的醋酸缓冲液，配制方法如下：

2M醋酸钠溶液：醋酸钠8.2g，加净化水溶解，定容至100ml，

2M醋酸溶液：冰醋酸6g，加净化水溶解，定容至100ml，

2M醋酸钠溶液10ml加2M醋酸溶液2ml，混匀，冰箱冷存48小时；

所述试剂B为1%铁氰化钾溶液，配制方法如下：铁氰化钾1g, 加净化水

溶解，定容至100ml；

    所述试剂C为2%三氯化铁溶液，配制方法如下：三氯化铁（含6分子

H2O）2g, 加净化水溶解，定容至100ml；                                                                              

所述试剂D为0.1M二氯化汞溶液，配制方法如下：二氯化汞2.7g，加净化水溶解，定容至100ml。

同型胱氨酸是含巯基（--SH）的氨基酸。同型胱氨酸中所含的巯基作为一种还原剂，可以使鉄氰化钾还原成亚鉄氰化钾，后者与三氯化铁反应生成普鲁士蓝而呈现蓝色；

3K4Fe(CN)6 + 4FeCl3 → Fe4[Fe(CN)6]3 + 12KCl

利用上述化学反应可以测定尿中巯基含量，并以此作为定论性定性指标，用于同型胱氨酸的检测。

但是，尿中存在的尿酸作为还原性物质也能使鉄氰化钾还原，故有干扰。研究发现：巯基在酸性环境中还原性较强，而尿酸在碱性环境中具有还原性。制作一个酸性环境则可基本排除尿酸对巯基检测的干扰。此外，二氯化汞可以与巯基特异性结合而使其失去还原功能，故以加用二氯化汞作为空白对照，可以排除尿酸等干扰物。

本发明提供的检测方法，简单实用，成本低廉，安全可靠，可快速的筛查出尿液中不含同型胱氨酸的样本、含同型胱氨酸的样本和可能含有同型胱氨酸的样本，为进一步检查做准备。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的说明。

实施例1

（1）请受检者留取尿液2ml以上；

（2）向测试孔和对照孔内分别滴入试剂A各100μL；

（3）再向测试孔和对照孔内分别滴入标本尿液各50μL,；

（4）再向对照孔内滴入试剂D50μL；

（5）再向测试孔和对照孔内分别滴入试剂B各50μL；

（6）再向测试孔和对照孔内分别滴入试剂C各50μL；