[发明专利]基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷

说明书

技术领域

本发明涉及构建一种基于共区域化触发链式杂交反应的腺苷适体传感器检测腺苷。

背景技术

腺苷是一种重要的生物药物小分子，参与机体多种生命活动的调节，具有重要的生理和药理作用，如舒张血管、收缩平滑肌以及对神经系统和免疫系统的调节作用。此外，生物样本中腺苷的检测可用于疾病诊断、病程的监测以及癌症的早期诊断。因此对腺苷的定量检测，尤其是生物样本中腺苷的检测在临床研究、疾病的诊断和预防以及癌症的早期诊断等方面有重要的生物学意义。

虽然大量的腺苷适体传感体系已成功实现了腺苷的分析检测，但是能够直接用于生物样本中腺苷检测的适体传感器却很少，这主要是以下两个原因造成的：1、生物样本中复杂体系的干扰，复杂的环境会对检测体系尤其含有蛋白酶的体系造成较大的影响；2、方法灵敏度不够，不能达到生物样本的检测标准，正常人尿液中腺苷的含量是2μmol L^-1～7μmol L^-1。而生物样本中腺苷的检测在疾病的诊断和预防以及临床研究方面具有较高的临床应用意义，例如生理状态下腺苷含量的波动可用于心、脑生理功能的研究，尿液中腺苷含量的升高可用于肿瘤的早期诊断。因此，建立一个高灵敏度、高选择性，能实现生物样本中腺苷直接检测的传感体系是十分必要的。

目前，为了实现高灵敏度的分析检测，多种信号放大技术如滚环扩增、外切酶辅助的信号扩增、核酸酶辅助的信号扩增以及基于聚合切刻酶等已被广泛用于腺苷的分析中。这些方法虽然能大大提高腺苷的检测灵敏度，但是均需酶的辅助作用。而蛋白酶和核酸酶的一些固有缺点(如易变性失活、高成本、需要特别的识别位点等)，大大限制了这些放大技术的广泛应用。近年来，粘性末端介导的链置换反应由于原理简单(碱基配对的基本原理)、无酶、反应快速和无需特别设计的优势而得以快速发展，基于发卡结构自组装的HCR和CHA反应是其中最为典型的两类方法。然而，非特异性反应的发生常常会造成较大的背景信号，影响方法的灵敏度，因此我们构建了一种基于共区域化触发的链式杂交反应的适体传感器，可以避免非特异性反应的发生，实现腺苷的高灵敏检测，同时实现生物样本中腺苷的直接分析检测。

发明内容

针对现有腺苷分析技术不能实现生物样本中腺苷的直接检测的问题，本发明的目的是提供一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，将该适体传感器用于腺苷的分析检测，具有灵敏度高、选择性强和重现性好等优点，并且可以直接用于人尿液中腺苷的含量测定，无需任何前处理过程。该适体传感器的工作原理是：首先，通过链酶亲和素和生物素之间的特异性作用，将生物素化的适体链-1(Bio-Apt-1)固定在磁球表面；然后加入腺苷和适体链-2(Apt-2)，通过腺苷的“粘合”作用，使得Bio-Apt-1和Apt-2结合在一起，从而使得Bio-Apt-1连接的粘性末端区域和Apt-2连接的链置换区域发生共区域化，形成完整的引物链，可以触发发卡结构H1和H2发生链式杂交反应(HCR)；反应完成后，加入内插染料SYBR Green I，产生荧光信号的输出。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器，由生物素化的适体链-1、适体链-2、发卡探针和链霉亲和素修饰的磁性纳米球组成，其中，所述生物素化的适体链-1(Bio-Apt-1)为：

5’-biotin-TTTTTTTTTTTT GTG CAA GTA CCA TT TAG ACC ACC TGG GGG AGT AT-3’(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)；

所述适体链-2(Apt-2)的序列为：

Apt-2：5’-ATA CTC CCC C AGGTGG TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’，(如SEQ ID NO.2所示)；

(注：Apt-2中斜体加粗序列是与Apt-1杂交的碱基)；

所述发卡探针由发卡探针H1和发卡探针H2组成，其中，发卡探针H1的核苷酸序列为：

5’-TGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CAC GCC GAA TCC TAG ACA TGG TAC TTG CAC-3’(如SEQ ID NO.3所示)；

发卡探针H2的核苷酸序列为：

5’-TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACA GTG CAA GTA CCA TGT CTA GGA TTC GGC GTG-3’(如SEQ ID NO.4所示)。