[发明专利]牛重大病原菌―多杀性巴氏杆菌基因诊断试剂盒及检测方法

说明书

 

技术领域

本发明属于生物科学技术领域，具体涉及牛重大病原菌的诊断试剂盒及检测方法，主要是针对多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida）基因诊断的试剂盒及检测方法。

背景技术

牛巴氏杆菌病又称为牛出血性败血症，是牛的一种急性、热性传染病，以发生高热、肺炎和内脏器官广泛出血为特征。病原为多杀性巴氏杆菌, 菌体为细小、两端钝圆的球杆状或短杆状菌，大小为1-1.5μm×0.3-0.6μm，多散在、无运动性、不形成芽胞，革兰氏染色阴性。多杀性巴氏杆菌对各种畜禽和野生动物都有致病性，不分年龄均可发生。牛群以黄牛、奶牛易感，其中青、壮年奶牛最易感，牦牛发病较少见。根据临床症状可分为败血型、浮肿型和肺炎型。但败血型以猝死为特征，而水肿型和肺炎型是在败血型的基础上发展而来的，因此在临床上以肺炎型为主的混合型最为常见。

败血型病牛常突然发病而死亡。表现体温升高，达41℃～42℃，心跳加快，精神沉郁，食欲减退或废绝，随后开始腹泻，呈粥样或水样，粪中混有粘液或血液，并有腹痛，不久体温下降而迅速死亡。病程很短，为12～24 h。常来不及查清病因和治疗，牛就死亡。

水肿型常发热，精神沉郁，反刍停止，流涎，流泪，流粘液样鼻汁，下颌和颈部发生炎性水肿，水肿还可蔓延到前胸、舌及周围组织。常伴有咳嗽，呼吸困难。后期倒地，体温下降，最后窒息死亡。病程为数小时至2d。

肺炎型主要是纤维素性胸膜肺炎症状。表现体温升高，呼吸促迫，继而呼吸困难，严重的头颈前伸，张口呼吸，黏膜发绀；流泡沫样鼻汁，有时带血，后变粘液脓性；咳嗽，胸部听诊有啰音，有时听到摩擦音，叩诊有浊音区，触诊有痛感。病初便秘，后期腹泻，粪中有血，有恶臭味。病程为3～7d左右。病死率高达80%以上。

可以说多杀性巴氏杆菌是细菌中对牛健康安全危害最大的种类之一，给牛养殖业带来较大的危害。多杀性巴氏杆菌引起的牛出血性败血症具有暴发快、流行广、死亡率高等特点，由于细菌极易对抗生素产生抗药性，因此对多杀性巴氏杆菌病应以预防为主，而这主要依赖于早期的快速检测。目前对多杀性巴氏杆菌的检测技术主要包括传统的TCBS培养及进一步的形态及生理生化鉴定法、免疫学方法（主要有单克隆抗体技术、酶联免疫检测法（ELISA））、 免疫电镜技术、分子生物学方法（主要有分子杂交技术、限制性内切酶长度多态（RELP））等。但是这些检测方法有些对技术条件要求高，检测时间长。有些所需的材料制备麻烦，费用高，有些方法灵敏度不高，特异性不强，因此广大兽医和牛养殖业主掌握的技术难度很大，很难推广，限制了这些技术的应用和发展。

早期快速诊断牛重大病原菌―多杀性巴氏杆菌是目前预防牛出血性败血症暴发流行的主要措施和牛养殖业减少损失的有效途径，因此，简便快速、特异性好又灵敏度高的诊断试剂盒及其检测方法是广大兽医工作者和牛养殖者急切盼望的。

多聚酶链式反应（polymerase chain reaction，简称PCR技术），是上世纪80年代发展起来的一种体外扩增特异DNA片断的技术，由于具有快速、敏感、特异性强等特点，所以这种方法建立后，很快就被应用于实践中。

发明内容

本发明的目的是利用多杀性巴氏杆菌毒素基因（toxA）保守序列设计的一对引物，建立多杀性巴氏杆菌PCR反应体系，在此基础上优化和设计，提供牛重大病原菌－多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒及检测方法。该试剂盒可批量生产，操作简单，简便快速，特异性好，灵敏度高；可用于牛出血性败血症的临床检测，也可用牛养殖过程中的细菌跟踪检测，也还可以用于养殖环境监测，避免病菌传播流行，具有很高的实用价值。

本发明采用的技术方案如下：

.牛重大病原菌－多杀性巴氏杆菌的基因诊断试剂盒，该试剂盒包括A液、B液、C液、盒子和泡沫板；

所述的A液为样品稀释液，内装无菌生理盐水，5管，每管5mL；

所述的B液为PCR反应液，1管，内装192μl PCR扩增反应液，包括168μl ddH₂O、14.4μl 含Mg²⁺ 的10×Buffer [Tris-HCl 100mmol/L 、pH为9.0, KCl 500mmol/L, MgCl₂ 15mmol/L,