[发明专利]一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法

权利要求书

1.一种体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，取人的包括表皮和真皮的正常皮肤组织，进行体外消化、分离，获得人的表皮细胞；然后将表皮细胞进行体外扩增培养；所述方法无需去除脂肪，无需将表皮和真皮进行分离。

2.如权利要求1所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)采集人的包括表皮和真皮的正常皮肤组织样本约0.5-5cm²，放入准备好的F12培养基中，冷藏保存；

(2)组织称重；

(3)组织用70％酒精润洗一下，然后放入含200U/ml青链霉素的PBS里浸泡5分钟，PBS用量以淹没过组织为准，然后换新的含青链霉素的PBS溶液再次浸泡5分钟；

(4)将组织完全切碎成匀浆；

(5)切碎后，每1g组织加入含有20ml消化液的离心管中，混匀；37℃水浴震荡消化90-120min；然后加入终浓度为0.05％的胰蛋白酶继续消化30min，最后再加100ul10mg/ml的脱氧核糖核酸酶消化5min；

(6)组织消化好后加相同体积的含有10％FBS的DMEM中和消化液，反复吸打50-100次；

(7)组织悬液用过滤器过滤，过滤后的液体1000rpm离心5min，弃上清；

(8)细胞沉淀用DMEM洗一次，然后离心弃上清；

(9)细胞沉淀用表皮细胞培养基重悬，铺在coating matrix预处理过的培养瓶或皿里面37℃、5％CO₂培养。

3.如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述步骤(5)的消化液为含2.5mg/ml胶原酶和2.5mg/ml分散酶的PBS溶液。

4.如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表皮细胞培养基，可以是MEM、DMEM、RPMI、F-12、CNT07培养基中的任意一种。

5.如权利要求2或4所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表皮细胞培养基中可以添加不同生长因子，包括表皮细胞生长因子EGF,表皮细胞生长因子B27、血小板补充液。

6.如权利要求2或4所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述培养基中加入2-10μM蛋白激酶抑制剂。

7.如权利要求2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述表皮细胞培养的培养基PH值为6-8；细胞的培养温度为30℃-40℃。

8.如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述方法在制作人造皮肤上的用途。

9.如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述方法在构建结构和功能上与正常皮肤类似的人工皮肤上的用途。

10.如权利要求1或2所述的体外分离培养人的表皮细胞的新方法，其特征在于，所述方法在自体细胞移植中的用途。