[发明专利]一种用于解析牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物实验技术，尤其是一种用于评价反刍动物瘤胃微生物群落多样性的DNA提取方法。

背景技术

反刍动物瘤胃内存在着丰富的微生物菌群，这些微生物菌群能够通过发酵，将难以消化的纤维素转化为可以被小肠吸收的蛋白质、氨基酸、糖类、酸类和脂类等，为反刍动物提供营养物质。另外，这些微生物对机体的免疫、生长发育等方面也有着巨大的影响。因此，它们的分离和鉴定对于研究瘤胃菌群功能具有重要作用。此外，瘤胃微生物作为一个巨大的基因库，探索其中具有应用价值的基因，可以应用于农牧业，医疗保健，生物化工等方面，从而更好地为人类服务。

传统分离瘤胃微生物的方法主要是通过选择性培养基分离法。由于培养条件的限制，迄今为止，瘤胃中微生物只有小部分能够被培养，绝大多数还不为人所知。近年来，随着分子生物学技术的发展，产生了一些新的微生物研究方法，如：变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gelelectrophoresis,DGGE)，末端限制性片段长度多态性(Terminal restriction fragment length polymorphisms,T-RFLP)以及高通量测序方法(high throughput sequencing technology)这些方法突破了微生物分离培养的限制，能够用于全面分析自然界的微生物类群及充分挖掘基因资源。然而，对于这些基于核酸技术来分析样本微生物结构的方法，DNA提取的质量好坏，会直接影响到微生物群落结构分析结果。因此，探索简便、高效、低成本的DNA提取方法将是研究瘤胃微生物菌落结构研究所面临的重要难题。

牦牛大多生活在高海拔，低氧，低温，采食恶劣的环境中，由于所处的恶劣让牦牛消化系统更加高效和稳定，保障其生存和繁衍。再加上如今经济全球化，环境污染和生物入侵日渐加重，青藏高原作为地球上不多的未受大规模污染的地方，不论生态环境还是饲养方法都是出于比较原始的状态。牧区由于畜牧医疗技术的相对落后及抗生素等药物的慎用，保证了牦牛瘤胃中的大量微生物是处在原始状态，未受到人为因素影响的。因此，牦牛也是研究瘤胃微生物群落结构的最好的模式动物。另外，与规模舍饲养殖的牛群相比，由于特殊的采食环境，牦牛瘤胃内往往含有大量的腐殖质和泥沙，这些物质会对DNA提取产生影响并增加基因组提取的难度，因此探索一套适合于牦牛瘤胃微生物DNA提取方法具有重要意义。

发明内容

鉴于现有技术的以上不足，本发明的目的提供一种更适合的牦牛瘤胃微生物结构多样性的DNA提取方法，使之更为准确地反映瘤胃中微生物的丰度及多样性。

为了达到上述目的，本发明采用以下技术方案来实现：

一种用于分析牦牛瘤胃微生物群落多样性提取方法，包括以下步骤：

(1)向0.5-2g牦牛瘤胃样品中加入10ml4℃样品洗涤液A，涡旋振荡1min4℃离心机，1000r/min,离心5min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液；再次向含有瘤胃内容物的离心管中加入4℃5ml洗涤液A，放置于涡旋震荡仪，振荡1min，吸取上清液。所有上清液于4℃，12000r/min离心10min，小心倒掉离心管上层清液，保留离心管底部的微生物和腐殖质，泥土混合物的沉淀层。

(2)微生物沉淀层里边加入60ul裂解缓冲液B，加入3ul蛋白酶K，颠倒混匀，放置于58℃恒温摇床孵育1h。

加入100ul NaCl溶液，加入80ul CTAB裂解液65℃水浴10min。

加入0.1g直径为0.2mm beads，放置于涡旋振荡仪上进行顺时针和逆时针涡旋交替震荡3min。

加入溶菌酶3mg,颠倒混匀，放置于37℃恒温摇床，孵育1h。

加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置，3min,12000r/min抽提蛋白质。

吸取上清液置新灭菌离心管中，加入等体积(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1)混匀于冰上静置3min。

12000r/min抽提蛋白质吸取上清液，置于新的灭菌离心管中，再次加入等体积(氯仿：异戊醇＝24:1)，混匀后放于冰上静置5min。

12000r/min离心5min,吸取上清液放置于新的离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，重悬，室温放置5min。

12000r/min离心10min，加入1ml70％冰乙醇洗涤。

12000r/min离心5min，加入50ul无菌水溶解。