[发明专利]一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，属于蛋白质的资源化利用领域。

背景技术

胶原是细胞外基质的主要成分，主要给细胞提供抗张力和弹性，在细胞的迁移和发育中起着重要的作用。胶原具有独特的三股螺旋结构，赋予了其优异的生物学性能，如低免疫原性、良好的生物相容性、细胞再生性和可降解性，因此被广泛的应用于生物医学材料领域。

在生理条件下，胶原溶液中分子间的相互作用可以使其自聚集成胶原纤维，自聚集的胶原纤维之间会形成网络结构并将溶液中的溶剂束缚在其内部使其不能自由移动，从而形成胶原凝胶，它被广泛的应用于药物缓释领域。然而，胶原本身自聚集成胶原纤维而形成的凝胶的稳定性还不够，一般在胶原凝胶中引入交联剂使其进一步固定。在动物体内胶原纤维的共价交联由赖氨酰氧化酶催化完成的，它能将赖氨酸和羟赖氨酸的ε-氨基氧化成醛基，醛基之间或醛基与周围的ε-氨基之间发生反应形成交联键。我们运用这种仿生的方法，在胶原中加入交联剂进一步固定胶原纤维，提高胶原凝胶的性能。

戊二醛和碳化二亚胺(EDC)是目前应用最为广泛的胶原凝胶的交联剂。Sheu等人的研究表明在胶原凝胶中加入0.2％的戊二醛，可以使凝胶的弹性模量从4320Pa大幅度增大到7230Pa，但用交联后的胶原凝胶培养细胞时会抑制细胞的繁殖。(Sheu M T,Huang J C,Yeh G C,et al.Characterization of collagen gel solutions and collagen matrices for cell culture.Biomaterials,2001,22(13):1713-1719.)所以说，给胶原凝胶中引入戊二醛会增加其细胞毒性，这在很多文献中都被证实。Hideki Mori等人以125mM的EDC为交联剂，胶原成纤维和交联同时进行，将胶原凝胶的弹性模量由44.1Pa提高到798Pa。(H.Mori，K.Shimizu，M.Hara.Dynamic viscoelastic properties of collagen gels in the presence and absence of collagen fibrils.Materials Science and Engineering C,2012,32：2007-2016.)这种交联剂有着较低的细胞毒性，但是，这种交联剂没有成为交联键的一部分，交联是“零长度交联”，用量较大(若达到相同的交联度，其用量是含有六个碳原子交联剂用量的近百倍)。(Grabarek Z.Gergely J.Zero-length crosslinking procedure with the use of active esters.Analytical Biochemistry,1990,185(1):131-135.)

羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯是一类新型低毒的蛋白质类交联剂。Hirofumi Saito等人制备出了柠檬酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(CAD)和苹果酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯(MAD)。该交联剂有较高的反应活性和良好的生物相容性。但用这种交联剂制备得到的胶原凝胶，与未加交联剂的胶原凝胶相比其弹性模量没有提高，CAD交联甚至会降低胶原凝胶的弹性模量。(H.Saito,T.Taguchi.et al.pH-responsive swelling behavior of collagen gels prepared by novel crosslinkers based on naturally derived di-or tricarboxylic acids.Acta Biomaterialia,2007,3:89–94.)这种胶原凝胶不稳定，容易破碎，不利于药物缓释领域中的应用。

发明内容

本发明的目的是针对现有胶原凝胶性能的不足而提供了一种以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法，其特点是用二元羧酸、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)合成了一种天然、无毒的交联剂，并将该交联剂用于胶原凝胶的改性，制备热稳定、吸水性、机械性能更好的胶原凝胶，用于药物缓释领域。

本发明的目的由以下技术措施实现，其中所述原料份数除特殊说明外，均为摩尔份数。

以二元羧酸-N-羟基琥珀酰亚胺酯为交联剂制备胶原凝胶的方法包括以下步骤：

1)胶原溶液的制备