[发明专利]一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌及其应用，属于遗传工程和发酵工程领域。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为一种真核模式微生物，因具有：遗传信息丰富，代谢改造操作方便；营养需求简单，分离提取工艺成本低廉；在低pH条件下(甚至pH<3.0)生长良好；能够耐受高浓度的底物；被FDA认证为GRAS(General Regarded As Safe)微生物，发酵产品具有安全性等优点而成为发酵生产羧酸(乳酸、丙酮酸、苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、α-酮戊二酸等)的潜在最适微生物。然而，酿酒酵母在高浓度糖及通风的条件分批发酵产生大量的乙醇，对于以羧酸为目标产物来说，乙醇的大量积累使得碳流大量的损失，成为代谢工程改造酿酒酵母生产羧酸面临的一大难题。

作为糖酵解的末端产物，丙酮酸在丙酮酸脱氢酶复合体(Pyruvate dehydrogenase complex,Pdh)的作用下，丙酮酸经脱氢转化为乙酰辅酶A，进而参与TCA循环。酿酒酵母的旁路代谢(Pyruvate dehydrogenase bypass,PDH bypass)也具有重要的生理作用，包括：(1)促进NAD⁺的再生，维持胞内氧化还原平衡；(2)合成胞质乙酰辅酶A，为合成细胞组成成分和氨基酸代谢提供前体物质；(3)产生乙醇。因此，乙醇的产生导致了碳代谢流及NADH辅因子的损失，从而严重影响了酿酒酵母对羧酸的积累效率。任何以羧酸为目标产物的酿酒酵母发酵工艺，都将面临同样一个问题：如何减少通往乙醇的碳代谢流，从而减少碳流的损失？本发明通过基因工程手段构建了一株乙醇产量大幅下降的酿酒酵母工程菌，对于利用酿酒酵母生产羧酸具有重要意义。

发明内容

本发明要解决的第一个技术问题是提供一种乙醇积累减少的酿酒酵母基因工程菌，以减少酿酒酵母生产羧酸过程中乙醇的积累，为代谢工程改造酿酒酵母高效生产羧酸打下基础。

所述工程菌是以酿酒酵母为出发菌株，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1。

所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733所示。所述乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。

所述工程菌优选酿酒酵母CEN.PK2-1C为出发菌株，购自EUROSCARF(http://web.uni-frankfurt.de/fb15/mikro/euroscarf/data/cen.html)；其基因型为：MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3,112；his3Δ1；MAL2-8^C；SUC2。敲除丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1；所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:850733所示。所述乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI Gene ID:854068所示。

本发明要解决的第二个技术问题是提供构建所述酿酒酵母工程菌的的方法，以pUG27质粒为模板通过PCR方法扩增得到敲除盒PDC1(1692bp)和ADH1(1544bp)，转化酿酒酵母，敲除乙醇途径中的关键酶基因丙酮酸脱羧酶基因PDC1和乙醇脱氢酶基因ADH1，筛选验证得到阳性转化菌株。

所述酿酒酵母优选酿酒酵母CEN.PK2-1C。

所述丙酮酸脱羧酶基因PDC1的核苷酸序列如NCBI中Gene ID：850733所示。

乙醇脱氢酶基因ADH1的核苷酸序列如NCBI中Gene ID：854068所示。

所述pUG27质粒的构建方法参见“Guldener U,HeckS,Fielder T,et al.A new efficient gene disruption cassette for repeated use in budding yeast.Nucleic Acids Res,1996,24(13):2519-2524”和“Guoqiang Xu,Qiang Hua,et al.Regulation of thiamine synthesis in Saccharomyces cerevisiae for improved pyruvate production.Yeast,2012,29:209-217”。

所述PCR使用的引物为：