[发明专利]甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法

权利要求书

1.一种甲醛交联/染色质免疫沉淀与分子克隆相结合筛选HSF靶DNA的方法，其特征在于包括如下步骤： 

步骤一、热激处理拟南芥幼苗； 

步骤二、甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联； 

步骤三、染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA； 

步骤四、染色质免疫沉淀DNA经过衔接头介导的PCR扩增后进行分子克隆及测序； 

步骤五、将测序结果在基因组数据库中分析、鉴定靶DNA片段在基因组上的位置。 

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤一中，热激处理拟南芥幼苗具体步骤为： 

取南芥幼苗放入培养缓冲液(SIB:0.5mMK₂HPO₄，0.5mMKH₂PO₄,pH6.0和0.1％蔗糖)39℃的水浴中震荡培养30min。 

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤二中，甲醛处理使HSF与靶DNA共价交联的具体步骤包括： 

将热激处理和未处理的南芥幼苗，在室温下浸入交联缓冲液中(0.4mM蔗糖,10mM Tris-HCl(PH8),1mMEDTA,1mMPMSF,1％甲醛),在真空下培养15min后加入终浓度为100mM甘氨酸在真空下培养5min以终止交联反应；南芥幼苗用无菌去离子水冲洗后，冻入液氮中，于-70℃下保存。 

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤三中，染色质免疫沉淀获得HSF的靶DNA的具体步骤包括： 

(1)破碎细胞 

(1.1)南芥幼苗加入3倍体积的裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mM PMSF)在研钵中研磨(在液氮中进行)；然后转移到10ml的离心管中； 

(1.2)超声波切断拟南芥基因组DNA，便其DNA片段化为100bp—600bp；超声波振幅为60％，每次30s，共处理20次； 

(1.3)12000rpm，4℃，离心5min收集上清液并过0.22um孔径的滤膜，滤液可直接进行染色质免疫共沉淀或液氮冷冻-70℃保存； 

(2)HSF抗血清与拟南芥细胞上清液共培养 

加60μlHSF抗血清于上述拟南芥细胞上清液中，4℃共培养4h；对照实验中加等体积的PBS缓冲液； 

(3)封闭和洗涤蛋白A琼脂糖胶 

在1.5mlEppendorf管中加入60μl50％悬浮的蛋白A琼脂糖胶，每次以1ml裂解缓冲液1(50mMHEPES-KOH，pH7.5，140mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)洗涤两次，1000rpm，4℃，离心1min，收集蛋白A琼脂糖胶；再加1ml1％BSA(溶于PBS)于上述蛋白A琼脂糖胶中，4℃共培养6h封闭其非特异性位点； 

用1ml裂解缓冲液1洗封闭后的蛋白A琼脂糖胶，1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 

(4)蛋白A琼脂糖胶和抗体共温育后的拟南芥细胞共培养 

蛋白A琼脂糖胶沉淀转入与抗体共温育后的拟南芥细胞破碎液中，4℃冰浴培养30min—1h；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀； 

(5)洗脱免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 

(5.1)加1.4ml裂解缓冲液1于免疫沉淀DNA和蛋白质复合物中，置于4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 

(5.2)加1.4ml裂解缓冲液2(50mMHEPES-KOH，pH7.5，500mMNaCl，1mMEDTA，1％TritonX-100，0.1％脱氧胆酸钠，1mMPMSF)，在4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；重复洗涤一次，离心收集沉淀； 

(5.3)加1.4ml洗涤液(10mMTris-HCI，pH8.0，0.25MLiCl，0.5％NP-40，0.5％脱氧胆酸钠，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min；1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀；将沉淀转移到另一干净的1.5ml Eppendorf管中，重复洗涤一次，离心收集沉淀； 

(5.4)加1.4ml TE缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0，1mMEDTA)，在4℃冰浴上洗脱5min,1000rpm，4℃，离心1min，收集沉淀； 

(5.5)加40μl洗脱缓冲液(1％[w/v]SDSand0.1MNaHCO₃,pH7.5)于上述沉淀中，60℃ 震荡10min,洗脱HSF结合的DNA；12000rpm,4℃，离心1min，收集洗脱液；再加60μl洗脱缓冲液重复洗涤一次，离心收集洗脱液； 

(6)KlenowDNA聚合酶和蛋白酶K处理免疫沉淀DNA和蛋白质复合物 

在0.5ml的Eppendorf管中依次加入上述试剂和免疫沉淀复合物,混匀后并短暂离心，在25℃反应30min，75℃加热10min； 

加入等体积(102μl)1mg/ml蛋白酶K(溶于50mMTris,10mMEDTA,0.3％SDS,pH7.5),60℃水浴过夜； 

(7)免疫沉淀DNA的分离纯化 

1)向上述获得的免疫沉淀DNA洗脱液中加入等体积的苯酚/氯仿(1:1)混合物，涡旋混匀； 

2)14000rpm离心3min，将上清转至新的1.5ml离心管中； 

3)加等体积苯酚/氯仿(1:1)，混匀后14000rpm离心3min； 

4)取上清，加等体积氯仿抽提，14000rpm离心3min； 

5)上清转至1.5ml离心管中； 

6)加1/10体积的醋酸钠，2.5倍体积100％的乙醇及20μg糖元，-20℃，静置过夜； 

7)14000rpm离心30min； 

8)去上清，用70％酒精洗沉淀； 

9)14000rpm离心30min； 

10)抽干，加入20μ1TE缓冲液(或无菌水)溶解沉淀，-20℃保存； 

(8)PCR分析免疫沉淀DNA 

(8.1)引物设计 

根据己发表的拟南芥热激基因及非热激基因的全基因序列分别设计HSP18.2启动子区引物. 

AtHSP18.2/-229u:5’-ATTTTTCTTGGCATTTCAGG-3’ 

AtHSP18.2/-243d:5’-GCATTTCGGTCTTGTTTCA-3’(52℃) 

(8.2)PCR反应 

反应体系如下： 

PCR扩增的参数为:94℃预变性5min，然后以94℃20s为变性参数，52℃20s为退火参数，72℃10s为延伸参数，循环数为25；经10％DNA聚丙烯酰氨凝胶分析PCR产物； 

(8.3)DNA-PAGE检测PCR产物 

按以下配方配制凝胶:30％丙烯酰胺2.5ml,5xTBEbuffer(445mMTris,445mM硼酸,10rnMEDTA,pH8.0)750μl,100μ110％的过硫酸氨(APS)和5μl的TEMED；凝固后加入1xTBE电泳缓冲液淹没凝胶的加样孔；取10μ1PCR产物和2μl6xLoadingBuffer混合后点样，在100V恒压条件下电泳60min,EB染色2-3min后凝胶成像仪观察并照相。