[发明专利]一种区位选择性细菌硝基还原酶基因、其重组酶及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组酶，及其在硝基区位选择性还原中的应用。

背景技术

芳香羟胺(又名芳胺)是一种重要的有机合成中间体，被广泛用于阻聚剂、抗氧剂、农药、医药、化妆品等的合成。某些芳香羟胺本身也具有很高的药理及生理活性。目前芳香羟胺的制备主要通过选择还原芳香硝基化合物来实现，常采用的方法有催化氢转移还原法、金属选择还原法、电化学还原法等。然而这些制备方法对羟氨还原的选择性比较差，中间体芳香羟胺迅速转化为相应的胺，且容易生成偶氮等一系列副产物。此外，化学还原羟氨在反应条件上也比较苛刻，需要使用危险的高压装置、易燃的氢气、有毒的重金属或有害的化学试剂等。相对于传统的化学制备方法，生物催化法除具有高效、特异的催化效率外，其最大的优势在于无可比拟的化学选择性和区域选择性。同时，生物催化的反应条件温和，可在常温常压、适宜pH的水相中进行反应，这与“可持续发展”“绿色化学”等工业发展目标相符。

硝基还原酶是一类依赖于FMN或FAD的细胞质酶，可利用NAD(P)H催化硝基还原，经亚硝基中间产物最终生成羟氨或氨基产物。利用硝基还原酶作为生物催化剂还原芳香硝基化合物生成相应的羟胺产物的还原过程，越来越受到人们的关注。虽然多数硝基还原酶可有效的实现单硝基化合物或无区位选择性差异的多硝基化合物的还原，但对于多硝基化合物的专一选择性还原却难以实现。目前绝大多数多硝基化合物上硝基都存在位置差异，以重要的工业原材料2,4-二硝基甲苯(24DNT)为例，硝基还原酶可催化该底物生成2-羟氨-4-硝基甲苯(2HANT)或4-羟氨-2-硝基甲苯(4HANT)。作为同分异构体的2HANT和4HANT，由于其羟氨基团取代位置的不同，在医药、农药合成及应用上也互不相同。但酶催化生成的羟氨混合产物由于化学性质相近，很难进行下一步分离纯化得到单一纯品，从而限制了硝基还原酶在羟氨生物合成中的应用。若能通过对酶分子的改造，使其在底物催化过程中专一性生成某一种目的还原产物，将大大减少后期分离纯化成本且绿色环保，有利于硝基还原酶在羟氨生物合成中的应用和开发。

因此，寻找开发具有不同专一还原选择性的硝基还原酶在羟氨化合物生物合成中具有显著的商业价值和应用前景。

发明内容

为获得专一区位选择性的硝基还原酶，本发明通过蛋白质结构及分子对接模拟分析，发现124的氨基酸残基通过与底物侧链基团的相互作用从而影响底物在活性中心的定位。若将124位的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)，可显著改变酶的区域选择性。与野生型硝基还原酶相比，突变体T41L/N71S/F124W对重要的工业原材料2,4-二硝基甲苯(24DNT)和2，4-二硝基苯甲醚(24DNAN)的还原由4-NHOH产物转为2-NHOH产物，实现2-NO₂的专一性还原。本文所述T41L、N71S、F124W的含义分别为：将41位的苏氨酸(Thr)突变为亮氨酸(Leu)(简写为T41L)，将71位的天冬酰胺(Asn)突变为丝氨酸(Ser)(简写为N71S)，将124位的苯丙氨酸(Phe)突变为色氨酸(Trp)(简写为F124W)。

目前硝基还原酶的生理底物和催化机制尚不明确，尤其是针对于外源的硝基芳香化合物而言，无法确定该底物在酶活性口袋内的正确定位，从而无法确定与侧链基团相互作用的关键氨基酸以及其是如何影响底物在活性口袋内的定位。即使单点突变对酶的区位选择性有一定程度的改变，但很难达到专一性区位选择性。通过对这一问题的分析，可能的原因是酶对底物的结合和定位通常不是由某一个氨基酸所决定的，而是通过活性口袋内的多个氨基酸共同作用实现的。同时对这些位点的突变具有很高的风险性和不确定性，虽然在一定程度上可实现区位选择性的改变，但可能引起酶催化活性的降低甚至丧失。针对这一问题，本发明在单点突变的基础上，进一步将有益突变位点进行组合突变，考察其对选择性实现的协同作用。

本发明具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，其重组酶和该重组酶的制备方法，以及该突变型硝基还原酶或含有该突变型基因重组表达转化体作为催化剂在羟氨化合物生物合成中的应用。

本发明的一方面在于提供一种突变型硝基还原酶的基因,命名为组合突变体T41L/N71S/F124W,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明的另一目的是提供上述突变型硝基还原酶基因编码的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。