[发明专利]一种高活性细菌硝基还原酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种突变型硝基还原酶的基因，以及含有该基因的重组表达转化体作为催化剂的应用。

背景技术

硝基还原酶是一类依赖于FMN或FAD的细胞质酶，可利用NAD(P)H实现硝基芳香族化合物和硝基杂环衍生物的还原代谢。该酶能够催化多种底物的硝基还原反应，在药物激活、羟氨合成及污染物生物代谢等诸多领域有着广泛的应用。Anlezark GM等人发现，大肠杆菌硝基还原酶NfsB能够激活癌症前药5-(1-氮丙啶)-2，4-二硝基苯甲酰胺(CB1954)，使其转化成为强细胞毒性的DNA交联剂，可同时杀死增殖期和休眠期的癌细胞。此外，硝基还原酶可在常温常压的条件下通过对苯环上硝基的还原，生成重要的羟胺类药物中间体或实现污染物的有效降解。相对于传统的物理和化学处理法外，硝基还原酶催化法反应条件温和、成本低且环境友好。

尽管硝基还原酶在催化反应中具有明显的优势，但催化效率低成为制约其广泛应用的主要因素。如NfsB-CB1954前药激活系统虽已进入三期临床阶段，但体内激活效率很低。CB1954对于NfsB而言是一个相当差的底物，K_m值高达860μM。临床实验中当药剂量达到人体承受最高值时，病人体内可达到的CB1954血药峰度仅为5-10μM，比K_m低大约100倍^[5]。因此，如果能降低NfsB对CB1954的K_m值，提高催化效率，将对NfsB-CB1954前药激活系统在临床上的广泛应用具有重要意义。

目前硝基还原酶改造的核心问题是生理底物和催化机制尚不明确，从而极大地限制了对该酶的理性改造。为获得更好催化活性的硝基还原酶，人们通常对所有可能的氨基酸位点采用随机突变的方法构建相应的突变体库，随后对突变库中大量的单点突变体、多点突变体进行活性筛选测定，获得所需要的突变体。虽然利用该方法人们也获得了一些活性较好的突变体，但是缺乏对氨基酸的功能性分析，加之基因突变方向的盲目性和不确定性，使得该过程需要大量的资金和人力。若能利用生物信息学和分子对接等模拟手段对氨基酸位点替换对底物结合和催化活性可能的影响做出预测，再结合体外定点突变实验，将显著提高突变实验的成功率。因此，基于蛋白氨基酸序列及晶体结构信息，利用定点突变手段对硝基还原酶进行理性改造，以获得高催化活性、特异性及热稳定性的应用型硝基还原酶，具有显著的商业价值和应用前景。

发明内容

为改善硝基还原酶催化活性差的现状，本发明基于现有技术中的硝基还原酶的氨基酸序列信息和蛋白晶体结构信息，利用生物信息学和分子对接等模拟手段对该分子中可能与底物结合和催化的关键氨基酸进行保守性和功能性分析，结合定点突变手段对硝基还原酶进行分子改造，以期得到高催化活性的硝基还原酶。具体为通过123位苯丙氨酸的缺失突变对硝基还原酶进行改造，从而为Phe124结合底物时发生位移提供更大的空间，提高酶的催化活性。

目前硝基还原酶的生理底物和催化机制尚不明确。对于外源的硝基芳香化合物而言，无法确定该底物在酶活性口袋内的正确定位方式，酶与底物之间如何进行相互作用以及酶如何实现底物的整个催化反应等问题尚不清楚，从而极大地限制了对硝基还原酶的理性改造。Grove JI等人曾对大肠杆菌硝基还原酶NfsB活性口袋内所有可能的位点进行了随机突变和组合突变筛选，发现仅有少量突变体表现出较好的活性，大多数突变体活性较野生型相比有显著的下降，甚至造成酶活性的丧失。此外，研究发现这些活性较好的突变体虽对测试底物CB1954表现出活性提高的特性，但对其他硝基类底物的催化活性并未得到改善，甚至还有不同程度的降低。

对上述现象分析发现，虽然酶活性口袋内的氨基酸可能直接影响酶对底物结合和催化过程，但由于其保守性较高且通常具有某些重要的生物学功能，对这些位点的突变具有很高的风险性和不确定性。针对这一问题，本发明在对关键氨基酸位点预测的基础上，进一步分析了这些位点的保守性和功能性(图1是NfsB与其他家族成员基因的多序列比对分析)，并首次将突变的位点着眼于保守性较低且对底物结合和催化过程起到间接性作用的氨基酸位点。即Phe123位点并不与底物直接发生相互作用，而是通过影响活性口袋内部氨基酸Phe124的作用而间接影响该酶的催化过程。

本发明的一方面在于提供一种突变型硝基还原酶的基因,所述硝基还原酶突变体是123位氨基酸苯丙氨酸Phe突变为丙氨酸Ala，命名为F123A。其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。