[发明专利]重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法

说明书

技术领域

本发明涉及的是利用大肠杆菌原核表达系统高效表达BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，并经过变性和透析复性，制备具有生物活性的重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚体的新方法。

背景技术

骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是1965年首次发现的一种能诱导常位及异位成骨的蛋白质,具有诱导间充质细胞和骨祖细胞分化为软骨细胞和成骨细胞从而诱导新骨生成的能力。目前已鉴定并克隆出20多种BMP，它们属于转化生长因子β(transforming growth factor,TGF-β)超基因家族中的成员，BMP2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一。BMP7主要在骨和肾中表达,BMP7具有强大的骨诱导活性,能刺激未分化的间充质细胞增殖及向成骨细胞或软骨细胞方向分化,并促进成骨细胞的增殖和碱性磷酸酶的分泌。由于骨形态发生蛋白BMP具有高效诱导成骨活性，因而具有重要的临床应用价值，包括用于修复骨缺损，用于脊柱融合术，治疗股骨头坏死，修复牙槽骨缺损等。

近年来，重组人骨形态发生蛋白BMP2和BMP7的安全性和有效性得到了充分的证实，美国FDA也于2002年7月批准重组人骨形态发生蛋白BMP2，BMP7用于脊柱融合和骨缺损修复。但由于动物细胞制备的重组人骨形态发生蛋白表达量低，制备成本高，致使治疗成本高达6000-10000美元，从而大大限制了BMP在临床上的应用。

1990年，Sampath等从牛骨中分离出一种分子量为30kDa的蛋白，实验证明其具有明显的成骨能力，经分析发现这种蛋白由两个亚基构成，测序证明前者为BMP7，后者为BMP2，且糖基化与否对其活性无影响。这说明BMP异源二聚体在自然情况下即存在。AkiAono等研究证明，BMP异源二聚体比同源二聚体具有更高的诱导成骨活性。

目前BMP蛋白的取得方式一般为从牛骨中提取，这种方式成本高，纯度低且易污染。且高等动物对异源的BMP具有免疫作用，会削弱BMP的诱骨活性。而使用昆虫细胞或动物细胞培养时间长，培养条件苛刻，成本高，不利于大规模生产的进行。致使BMP蛋白的价格过高，增加了病人的负担，限制了其在临床上的广泛应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白及高效表达和复性方法，本发明利用大肠杆菌表达系统，高效、低成本地表达重组人骨形态发生蛋白BMP7/BMP2异源二聚体蛋白，这种异源二聚体蛋白是用一段柔性肽将BMP7和BMP2成熟肽相连，此蛋白具有比BMP2或BMP7同源二聚体更高的诱骨活性，经过简便的复性步骤，产生有诱骨活性的BMP蛋白，使其在临床上得到广泛应用成为可能。

本发明实现目的的技术方案如下：

一种重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白，所述蛋白从N端到C端的顺序是BMP7-连接肽-BMP2，所述连接肽是由3个GlyGlyGlyGlySer重复氨基酸序列组成。

表达重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白的基因工程菌，所述宿主菌为大肠杆菌感受态BL21(DE3)，所述表达载体为pHis-NusA，所述载体的目的序列为BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列。

而且，所述表达载体为pHis-NusA的克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ。

而且，包括如下步骤：

⑴将BMP7和BMP2成熟肽基因通过编码连接肽的DNA片段连接，获得编码BMP异源二聚体的核苷酸序列；

⑵将步骤⑴所获得的DNA序列克隆到表达载体上；

⑶将重组质粒转化至宿主菌，诱导蛋白表达；

⑷离心收集菌体，用裂解液重悬菌体，超声破碎，离心收集沉淀；

⑸进行表达蛋白包涵体的洗涤纯化，并进行复性。

而且，所述步骤⑵中克隆位点为Nde Ⅰ和EcoR Ⅰ，表达载体为pHis-NusA。

而且，所述步骤⑶中宿主为大肠杆菌。

而且，所述步骤⑸中包涵体洗涤剂为：0.1M磷酸钠，250mM NaCl，4M urea，1％Triton X-100，1mM EDTA，PH＝7.4。

而且，所述步骤⑸中复性方法采用透析复性，复性过程尿素浓度梯度为8M-2M-1M-0M。

重组人骨形态发生蛋白异源二聚体蛋白的复性方法，所述方法包括以下步骤：