[发明专利]植物基因组定点修饰方法

权利要求书

1.一种植物基因组定点修饰方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将一表达嵌合RNA和Cas蛋白的核酸构建物导入植物细胞，获得转化的植物细胞，其中所述嵌合RNA是由特异性识别待定点修饰的CRISPR RNA和反式作用型CRISPR RNA所构成的嵌合体；和

(b)在合适的条件下，使转化的植物细胞中的所述核酸构建物转录形成嵌合RNA，并且使所述转化的植物细胞表达所述的Cas蛋白，从而使得在所述嵌合RNA的引导下，在所述转化的植物细胞中，通过所述Cas蛋白对基因组DNA进行定点切割，从而进行基因组定点修饰，其中所述核酸构建物包括第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物，其中第一亚核酸构建物和第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的；

其中，第一亚核酸构建物包括从5'至3'的以下元件：

第一植物启动子；

与所述第一植物启动子操作性相连的嵌合RNA的编码序列，所述嵌合RNA的编码序列的结构如式I所示：

A-B (I)

式中，

A为编码CRISPR RNA的DNA序列；

B为编码反式作用型CRISPR RNA的DNA序列；

“-”表示A和B之间的连接键或连接序列；其中，由所述嵌合RNA的编码序列转录形成一个完整的RNA分子，即嵌合RNA；和

RNA转录终止子；

第二亚核酸构建物包括5'至3'的以下元件:

第二植物启动子；

与所述第二植物启动子操作性相连的Cas蛋白的编码序列，并且所述Cas蛋白的是N端、C端或两侧与核定位序列融合的融合蛋白；和

植物转录终止子；

其中，所述的第一植物启动子选自下组：AtU6-26、OsU6-2或其组合，并且所述的第二植物启动子和与所述Cas蛋白的编码序列之间5'至3'还操作性相连有：

第三亚核酸构建物，其中，所述的第三亚核酸构建物为来源于番茄矮壮病毒的p19蛋白编码序列；和

自剪切序列，其中，所述的自剪切序列为2A多肽编码序列。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一亚核酸构建物的数量为一个或者多个，并与第二亚核酸构建物是相互独立的，或是一体的。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点修饰包括：

(i)在没有供体DNA的情况下，对植物基因组特定位点进行随机插入和缺失；和

(ii)在存在供体DNA的情况下，以供体DNA为模板，对植物基因组特定位点进行精确插入、缺失或者替换DNA序列。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述定点修饰包括对植物基因组的基因敲除，基因敲入以及调控內源基因的表达水平。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物、或其组合。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的植物选自下组：林业植物、农用植物、或其组合。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的林业植物包括观赏植物。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的农用植物包括经济作物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第一植物启动子为RNA聚合酶III依赖的启动子。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的第二植物启动子为RNA聚合酶II依赖的启动子。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述第二植物启动子包括组成型表达的启动子或拟南芥生殖细胞特异性表达的SPL启动子。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：检测所述转化的植物细胞中基因组的突变或修饰情况。