[发明专利]超分辨荧光寿命相关光谱系统

说明书

技术领域

本发明涉及一种超分辨荧光寿命相关光谱系统，属于显微成像领域。

背景技术

由于非侵入式、三维成像和可特异性标记成像等不可替代的优势，光学显微镜成为当今生命科学中重要的研究工具，但是由于光学衍射的限制，传统光学显微镜只能达到波长量级的空间分辨率，限制了它在纳米尺度对细胞内分子结构和功能研究中的应用。2006年以来各国研究人员提出了光活化定位显微镜(PALM)、随机光学重构显微镜(STORM)、受激辐射耗尽(Stimulated emission depletion-STED)显微镜等几种突破衍射极限的荧光成像新原理，其中STED显微镜以其时间分辨的优势在对动态过程的成像应用中具有很大的前景。

STED显微镜作为一种超分辨的共聚焦光学显微镜，是一种扫描成像技术，它是在传统共聚焦显微镜的基础上，添加一路STED光束，通过调制STED光束波前在物镜焦平面上形成空壳形状焦斑，将激发光衍射光斑周围的荧光分子转换为非辐射态，实现了好于50纳米的空间分辨率。目前超分辨的共聚焦光学显微镜的研究还处于起步阶段，与其它探测技术的结合尚未开展。

荧光相关光谱(Fluorescence Correlation Spectroscopy-FCS)是一种可以在溶液中研究荧光标记的单个或多个分子荧光特性的光学技术，通过对荧光强度波动的自相关分析可以得到细胞内荧光标记的生物大分子的浓度、扩散系数、化学反应速率常数等参数，因此FCS可以应用于研究细胞内DNA和蛋白质构象的变化、大分子的扩散和旋转、细胞膜的流动特性、细胞配体与受体的相互作用和化学反应过程分析等，成为生命科学中单分子研究的重要工具。

但是FCS有一个很大的缺点是无法区分扩散系数相近的两个分子，而且当溶液中多于两种荧光分子时的相关分析更加复杂，虽然可以使用荧光互相关光谱(Fluorescence Cross-Correlation Spectroscopy-FCCS)技术探测多颜色通道使相关分析简化，但是增加探测通道会增加系统的复杂性，而且还会面临串色等问题。

为了降低FCCS系统的复杂性和不确定性，荧光寿命相关光谱(Fluorescence Lifetime Correlation Spectroscopy-FLCS)技术被提出来，FLCS系统最大的优点是可以使用一路激发光和一路探测装置，通过荧光寿命的不同从混合溶液中分离出不同的荧光分子，FLCS可以实现荧光自相关和互相关分析。FLCS系统不仅可以实现传统FCCS的功能，而且简化了传统FCCS装置，降低了背景信号的干扰，所以成为了生命科学中重要的研究工具。

FLCS是基于共聚焦显微术的，探测荧光的区域为一个光学衍射极限下的艾里斑体积，FLCS系统获得的光强波动来自于此焦斑内所有荧光分子辐射荧光的统计平均值，由于衍射极限的限制，共聚焦显微镜的有效焦斑体积大于0.1飞升，为了获得信噪比较好的相关曲线，通常探测体积内的平均分子数应小于10个，因此需要溶液浓度小于0.1微摩尔每升数量级，而细胞中的许多大分子通常是浓稠的，这严重限制了FLCS在研究细胞内分子的运动中的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种超分辨荧光寿命相关光谱系统，通过在共聚焦光学显微镜中加入第二路调制光，实现超分辨的共聚焦光学显微成像，突破传统的光学衍射极限的限制；在此基础上实现的荧光寿命相关光谱可以在探测体积小于共聚焦衍射斑体积下探测荧光强度的波动，提高了FLCS可探测的最大浓度。

本发明所提供的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，激光器a输出的激光经二向色性滤光片a滤光后汇聚至显微物镜，激光器b输出的激光依次经位相板和二向色性滤光片b滤光后入射至所述显微物镜；经所述显微物镜汇聚的激光照射至样品台，得到待测样品的荧光信号又经所述显微物镜汇聚后经收集透镜收集后入射至光电探测器，所述光电探测器输出的光电信号输入至光学信号采集器；

所述激光器a和所述激光器b的同步触发信号输入至所述光学信号采集器。

上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述激光器a输出和所述激光器b输出的激光在汇聚至所述显微物镜之前均经一反射镜，以调整光路对准。

上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述待测样品的荧光信号在入射至所述收集透镜之前经过一反射镜和一滤波片，分别用于对准光路和滤除激发光。

上述的超分辨荧光寿命相关光谱系统中，所述光学信号采集器与控制采集处理软件相连接，由所述控制采集处理软件进行重构和处理获得超分辨荧光显微图像和相关曲线。