[发明专利]含人类骨保护素基因的重组慢病毒载体及其制备方法和应用在审
| 申请号： | 201410331750.7 | 申请日： | 2014-07-11 |
| 公开（公告）号： | CN104651386A | 公开（公告）日： | 2015-05-27 |
| 发明（设计）人： | 苏方;刘洪臣 | 申请（专利权）人： | 中国人民解放军总医院;中国人民解放军第306医院 |
| 主分类号： | C12N15/66 | 分类号： | C12N15/66;C12N15/867;C12N7/01;C12N5/10;A61L27/38;A61L27/12;A61L27/54 |
| 代理公司： | 北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) 11201 | 代理人： | 李志东 |
| 地址： | 100853*** | 国省代码： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 人类 保护 基因 重组 病毒 载体 及其 制备 方法 应用 | ||
1.一种制备含有人类骨保护素基因重组慢病毒载体的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)合成人类骨保护素基因的编码序列区域；
(2)将人类骨保护素基因的编码序列区域克隆连接到T载体上；
(3)使用第一引物从连接骨保护素的T载体扩增两端含有酶切位点的人类骨保护素基因的编码序列片段；
(4)将步骤(3)得到的基因片段连接到pIRES-EGFP载体上，获得OPG-IRES-EGFP载体；
(5)将步骤(4)制备的OPG-IRES-EGFP重组载体转化大肠杆菌，筛选阳性克隆；
(6)使用第二引物从阳性克隆扩增出OPG-IRES-EGFP序列，亚克隆到载体pcDNA6.2w上；
(7)将步骤(6)制备的重组载体上的所述OPG-IRES-EGFP序列经BP重组反应到入门载体上，再经LR重组反应到pLenti6.3/V5载体上，得到pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP重组载体。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述第一引物序列为SEQ NO.1和SEQ NO.2所示的核苷酸序列。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述酶切位点是BglI和BamHI位点。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(6)中所述第二引物序列为：SEQ NO.3和SEQ NO.4所示的核苷酸序列。
5.一种含骨保护素基因的重组慢病毒载体，其特征在于，是根据权利要求1至4中任一项所述的方法制备的。
6.权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备含有人类骨保护素基因的重组慢病毒中的用途。
7.权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备过表达人类骨保护素基因的牙周膜干细胞中的用途。
8.权利要求5所述的重组慢病毒载体在制备含有骨保护素基因修饰的组织工程化骨中的用途。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述组织工程化骨是通过将所述含有人类骨保护素基因的牙周膜干细胞同β-磷酸三钙支架材料体外复合，获得所述含有骨保护素基因修饰的组织工程化骨。
10.根据权利要求9所述的用途，其特征在于，制备所述组织工程化骨的方法包括以下步骤：
(1)磷酸三钙支架材料的制备；
(2)将pLenti6.3-hOPG-IRES-EGFP转染后的牙周膜干细胞与磷酸三钙支架材料的体外复合。
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