[发明专利]海南毒素‑IV类似物rHNIV‑01的表达载体及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体及其制备方法。

背景技术

肽类药物由于其选择性高，体内无结存等特点，越来越受到各大制药公司的青睐。特别是含有多对二硫键的多肽分子比线性多肽分子具有更加优秀的稳定性和吸收性，因此是药物设计开发的一个热点。天然海南毒素-IV(HNTX-IV)是从我国特有的海南捕鸟蛛里面分离到的一种神经多肽类毒素。它含有35个氨基酸，C端有酰胺化修饰，含有三对二硫键，且二硫键的配对是典型的ICK模体(Cys2-Cys17，Cys9-Cys24，Cys16-Cys31)。通过前期研究结果表明HNTX-IV能够选择性的高效抑制大鼠背根神经节(DRG)细胞上的河豚毒素敏感(TTX-S)型电压敏感钠通道(VGSC)电流。进一步的研究结果表明，HNTX-IV的结构中有一个富含正电荷的表面(Lys27，His28，Arg29，Lys32)，该表面对于HNTX-IV结合VGSC有重要的作用。为了更好的研究和开发HNTX-IV，使其直接成药或者作为药物先导分子开发，势必需要制备一系列的HNTX-IV类似物以供研究。

rHNIV-01作为一种重要的HNTX-IV类似物，与天然HNTX-IV相比，仅在C端缺少酰胺化修饰，rHNIV-01对应的氨基酸序列为：ECLGFGKGCNPSNDQCCKSS NLVCSRKHRWCKYEI(SEQ ID NO.11)。获取rHNIV-01一般通过化学合成或者利用微生物进行异源表达。根据专利申请人多年的多肽制备经验，氨基酸长度在30个以上，同时含有多对二硫键的小分子多肽，因需要反复的变复性(形成二硫键)和纯化，导致其成本相当昂贵；利用微生物进行重组表达则成本相对低廉很多。通过微生物获取工业级别的大量重组多肽，只能是通过大肠杆菌或者毕赤酵母。但是使用毕赤酵母，存在产物均一化程度不高的问题，而且相对大肠杆菌制备，有更高的技术门槛。目前还没有使用大肠杆菌来制备rHNIV-01类似物的报道。

发明内容

本发明旨在克服现有技术的不足，提供一种海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体。

为了达到上述目的，本发明提供的技术方案为：

所述海南毒素-IV类似物rHNIV-01的表达载体的序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了上述表达载体的制备方法，该方法是以pET-43a载体为模板，用SEQ ID NO.5—10所示的引物进行无缝克隆：将编码GST序列替换pET-43a载体中的NusA序列，同时将编码SUMO序列插入编码GST序列的下游，再将编码rHNIV-01序列插入编码SUMO序列ULP1酶切割识别位点的下游，得PCR产物；将PCR产物经DpnI消化后直接转入大肠杆菌，优选大肠杆菌DH5α培养，提取质粒后经DNA测序验证，即得rHNIV-01的表达载体，命名为pWE-rHNIV-01，其序列如SEQ ID NO.4所示；其中所述编码GST序列如SEQ ID NO.1所示，编码SUMO序列如SEQ ID NO.2所示，编码rHNIV-01序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供了上述述海南毒素-IV类似物rHNIV-01的制备方法，包括如下步骤：

(1)将上述表达载体pWE-rHNIV-01转入大肠杆菌BL21，然后将大肠杆菌培养后进行rHNIV-01融合蛋白的诱导表达；

(2)将经步骤(1)诱导表达后的大肠杆菌菌体悬浮后破碎并离心，将离心所得上清液经透析并再次离心后用ULP1激酶消化，得消化产物；

(3)向消化产物中加入质量百分比浓度为6—8％的TCA，抽提rHNIV-01融合蛋白，得到rHNIV-01融合蛋白溶液，经透析后冷干保存；

(4)将步骤(5)所得冻干保存的透析产物经RP-HPLC纯化后得纯化后的rHNIV-01。

本发明还提供了一种用于制备上述表达载体的试剂盒，所述试剂盒包括SEQ ID NO.5—10所示的引物。

本发明中所涉及的其他各种实验操作，均为本领域的常规操作技术，文中没有特别说明的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：