[发明专利]稳定表达人MATE1转运体的细胞模型的构建及应用

权利要求书

1.一种构建pcDNA3.1（+）-hMATE1重组质粒的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：先从冰冻人肾脏组织中提取总RNA，经逆转录PCR获得cDNA文库，通过设计含有Hind Ⅲ和KpnⅠ两个酶切位点的特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID No：1和SEQ ID No：2所示，以该cDNA为模板特异性扩增获得人SLC47A1基因的编码区域片段，得到的目的基因片段通过Hind Ⅲ和KpnⅠ两个酶切位点连接到表达载体质粒pcDNA3.1(+)-Hygro上，构建pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒。

2.根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK细胞48小时后，在培养基中加入400μg/ml的潮霉素B进行抗性筛选，持续筛选两周后，通过有限稀释法挑选培养单克隆细胞，经过荧光底物DAPI初步筛选过量表达hMATE1的单克隆，采用Real-Time PCR 法进行mRNA水平验证并以甘油醛-3-磷酸脱氢酶为内参进行hMATE1 mRNA的相对含量测定，GAPDH和hMATE1各自的上、下游引物序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4和SEQ ID No：5、SEQ ID No：6所示，MDCK-hMATE1细胞模型通过对经典底物MPP⁺和二甲双胍在有或无阳性抑制剂西咪替丁存在下的摄取能力进行功能确证。

3.根据权利要求2所述方法构建的稳定表达hMATE1的MDCK-hMATE1细胞模型在高通量快速筛选MATE1底物和抑制剂中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，底物筛选通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH₄Cl的人工摄取缓冲液孵育20min，换成AUB继续孵育5min，完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，在MDCK-pcDNA3.1和MDCK-hMATE1细胞同时进行待研究药物孵育相同时间的实验，若待研究药物在MDCK-hMATE1细胞上的积聚量超过mock细胞上积聚量的2倍，则可认为待研究药物是MATE1的底物。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，抑制剂筛选通过以下步骤实现：在待研究药物孵育前，先用添加30mmol/LNH₄Cl的AUB孵育20min，换成AUB继续孵育5min，完成前两步预孵育后方进行待研究药物的孵育，MPP⁺、二甲双胍作为MATE1的经典底物，分别与不同浓度的待研究药物共孵育，通过检测药物对细胞内MPP⁺或二甲双胍积聚量的影响，计算待检测药物对MPP⁺或二甲双胍的抑制率及IC₅₀值，MPP⁺和二甲双胍都采用液质联用法进行测定。

6.根据权利要求1所述方法获得的pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒构建稳定表达hMATE1的MDCK-hOCT1/hMATE1细胞模型的方法，其特征在于，通过以下步骤实现：用pcDNA3.1(+)-hMATE1重组质粒转染MDCK-hOCT1细胞，挑选获得单克隆的方法、荧光底物DAPI的筛选方法与获得MDCK- hMATE1细胞模型的方法相同，以GAPDH为内参进行hMATE1 mRNA的相对含量测定时，同时测定细胞中hOCT1 mRNA的相对含量，GAPDH、hMATE1及hOCT1各自的上、下游引物序列如SEQ ID No：3、SEQ ID No：4，SEQ ID No：5、SEQ ID No：6及SEQ ID No：7、SEQ ID No：8所示，MDCK-hOCT1/hMATE1细胞进行MPP⁺的摄取实验验证功能，进行MDCK-hOCT1/hMATE1单层细胞对西咪替丁的转运能力验证实验，在costar转运板的给药池加入20μmol/L西咪替丁，每20min在接收池取100μL缓冲液进行含量测定，转运实验进行2hrs，西咪替丁采用液质联用法进行测定。