[发明专利]一种单引物引发的核酸恒温扩增方法

说明书

技术领域

本发明属于核酸检测技术领域，具体涉及一种单引物引发的核酸恒温扩增方法。

背景技术

核酸检测已经广泛应用于临床诊断，环境监测以及传染疾病的预防与控制等许多方面，聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)能对微量核酸模板进行指数性扩增，其高灵敏度使其成为目前使用最广泛的核酸扩增方法，然而，传统PCR需要使用热变性的方法制备单链核酸模板，使引物与模板退火，此过程需要具有精确调控温的仪器。此外，PCR反应的特异性取决于引物退火的特异性，为了得到特异性的扩增，常常需要对退火温度进行优化，工作较繁琐。此外，PCR的产物也可以作为模板进行扩增，大量的产物极大的增加了污染的可能性，因此，对产物的处理要非常谨慎。为了克服上述传统PCR费时、费力、工作繁琐等的缺点，自20世纪90年代初以来很多实验室尝试发展无需热变性的DNA等温扩增技术。美国New England Biolabs的研究人员模拟生物体内DNA的复制机制发明了一种新的体外恒温基因扩增技术--依赖于解旋酶恒温基因扩增技术(Helicase Dependent Isothermal DNA Amplification,HDA)，此方法使用解旋酶将双链核酸变成单链核酸，代替了传统PCR的热变性方法，使得整个反应可以在恒温下进行，是一种恒温条件下进行的PCR反应，不需要温度的反复调控，省时、省力。但是此过程需要加入打开双链核酸的解旋酶、使核酸保持单链状态的单链DNA结合蛋白(SSB)和聚合酶，导致检测费用增加。1992年美国Becton Dickinson研究中心的Walker等首次报道链置换扩增技术(Strand Displacement Amplification,SDA)，其首先使用热变性方法将双链DNA转变为单链，带有限制性内切酶识别序列的引物与单链模板退火，聚合酶延伸形成模板的互补链，加入的外引物链置换下形成的模板互补链，另一个带有限制性酶识别序列的引物与形成的模板互补链退火，延伸，实验中使用硫代dNTP作为合成底物，使得内切酶只能裂解其中一条链，形成切口，聚合酶和内切酶共同作用进行指数扩增。此方法需要预先的热变性过程，需要额外的加入硫代dNTP合成底物，增加了设计的复杂性和实验费用。虽然后来切刻酶的发明解决了使用硫代dNTP合成底物来使内切酶裂解其中一条链的问题，节约了硫代dNTP合成的成本，但是需要设计四条引物和预先高温变性的问题仍没有解决。环介导等温扩增技术(Loop Mediated Isothermal Amplification，LAMP)是由日本学者Notomi等于2000年建立的一种新的体外扩增特异DNA片段的分子生物学技术，该技术是用4条特异性引物分别识别目标DNA的6个特定区域，通过2个环状结构和链置换反应实现DNA的快速等温扩增。LAMP反应过程包括哑铃状模板合成阶段、循环扩增阶段、伸长和再循环阶段。其特别之处在于引物的设计，它包括2条内引物FIP、BIP及2条外引物F3、B3，其中两条内引物在模板上延伸之后会自身形成茎环结构，两条外引物在聚合酶延伸作用下，链置换下延伸的内引物。该方法反应迅速，一小时内可有效的扩增检测1-10个拷贝的目的基因，特异性强，恒温检测，不需要特殊的仪器。但是此方法四条引物设计比较困难，对设计人员要求高，此过程双链的解离需要依靠加入解链温度调节剂，并且扩增的含有重复结构的大量产物易形成气溶胶，造成假阳性结果。

发明内容

本发明为解决现有技术中所存在的不足，本发明所要解决的技术问题是提供一种单引物引发的核酸恒温扩增方法，避免了现有的传统恒温检测方法中需要预先通过变温手段打开双链核酸再进行扩增及引物设计复杂，检测成本高等缺点。

本发明提供的技术方案为：

一种引发核酸恒温扩增反应的单引物，引物至少含有a、b’、x、c四个区，其中b’区和a区的5’侧相连，x区和b’区的5’侧相连，c区和x的5’侧相连；a区是和靶标核酸互补配对的核苷酸序列，b’区是与使用该引物延伸合成反应产物的3’末端区域互补的核苷酸序列，x区包含切刻酶的识别位点和切刻位点核苷酸序列，c区是利用其合成的互补核酸进行信号检测的核苷酸序列；引物a区聚合延伸形成b区，形成的a+b区可在反应温度下与模板核酸动态解离；引物延伸形成的b区与引物原有序列自身折叠互补配对，形成自身茎环结构；形成的茎环结构3’端在聚合酶作用下延伸形成切刻酶切刻位点。