[发明专利]一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株及构建方法和应用

说明书

本发明公开了一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron株及构建方法和应用，步骤是：A、Intron上下游同源臂的PCR扩增；B、转染载体的构建。将Intron基因上下游同源臂片段通过分子克隆技术克隆至pcDNA3.1(+)载体上；C、PRV‑ΔIntron重组病毒的构建与鉴定；D、PRV‑ΔIntron重组病毒体外培养生物学特性。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株接种PK‑15细胞；E、动物实验。将制备的伪狂犬病毒ΔIntron基因缺失毒株感染Balb/c小鼠，Intron的缺失导致其毒力大大降低。该毒株表达miRNA的区域缺失，丧失了对宿主和自身蛋白质编码基因的调控作用，导致毒力下降，具有开发成为新型疫苗的潜在价值。方法易行，操作简便，缺失区域遗传稳定，不会返强。用于制备新型伪狂犬病疫苗，预防和控制猪伪狂犬病。

技术领域

本发明涉及动物病菌基因工程技术领域。具体涉及一个伪狂犬病毒鄂A株PRVIntron缺失突变活毒株，同时还涉及一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株的构建方法，还涉及一种伪狂犬病毒LLT区ΔIntron突变株的用途。

背景技术

伪狂犬病(Pseudorabies,PR)，又名奇痒症、奥叶基氏病(Aujeszky's disease,AD),是由伪狂犬病毒引起的以发热、奇痒(猪除外)、脑脊髓炎为主要特征的一种烈性传染病(殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京:科学出版社,1997:700-713.McCracken RM,McFerran JB and Dow C.The neural spread of pseudorabies virus in calves.J GenVirol,1973,)。伪狂犬病病原为疱疹病毒科、α疱疹病毒亚科的伪狂犬病毒(PRV)。

伪狂犬病毒感染宿主谱非常广泛，包括啮齿类动物、家畜、犬类和猫科动物，然而其感染自然宿主——猪和非自然宿主所引起的临床症状和结局是不同的：成年猪感染野生型PRV后主要表现为呼吸系统和繁殖系统疾病症状，很少发生死亡；非自然宿主感染PRV后表现奇痒及神经症状，大多以死亡告终(Pomeranz et al,2005)。

本病广泛分布于世界各地，已有50多个国家和地区报道该病的流行(李春华,王英,蒋凤英,胡建华.猪伪狂犬病研究进展.动物医学进展,2008,29:68-72.)。我国于上世纪40年代末在猫中首次分离到伪狂犬病毒，60年代初随着养猪业的发展，伪狂犬病开始在猪群中流行(童武等，2013)。该病对养猪业的危害主要表现在以下几个方面：a.妊娠母猪感染后表现流产，产死胎或木乃伊胎。b.15日龄内哺乳仔猪出现神经症状后一般24～36h内死亡，死亡率可达100％。c.断奶仔猪发病表现为拉稀、运动失调、颤抖、口吐白沫等，比哺乳仔猪死亡率低。d.感染公猪发生睾丸肿胀、萎缩，丧失种用价值；母猪表现屡配不孕、不发情或返情。e.感染育肥猪表现为呼吸道症状，极少病例出现神经症状，死亡率极低，但增重迟缓、饲料报酬降低，影响经济效益(刘正飞,陈焕春,吴斌,何启盖,秦永辉.伪狂犬病病毒鄂A株TK-/gE-/gI-基因缺失疫苗的安全性和保护力研究.畜牧兽医学报,2004,35:70-73.)，且感染后耐过的猪成为PRV最主要的储存宿主和传播者。