[发明专利]同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学的病毒检测领域，具体的说，涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法。 

背景技术

柑桔是世界第一大水果，我国柑桔栽培面积和产量均居世界首位，在国民经济中占有十分重要的地位。近几年来，随着我国柑桔产业的发展和优势产业带的确立，柑桔的种植区域更趋集中，面积亦进一步扩大，而病害问题日益引起生产者的重视。随着国际柑桔贸易的持续增长及种质资源交换的日益频繁，各种检疫性柑桔病害传入我国的机率不断加大。 

温州蜜柑萎缩病毒(Satsuma dwarf virus，SDV)引起的温州蜜柑萎缩病主要危害温州蜜柑，造成温州蜜柑果实的畸形，影响果实品质，使其失去经济价值。一般发病10年以上的植株明显矮化，产量锐减(只有健康树的40-50％)，严重时全无收成。病树主干直径比健康树小20-30％，树冠小50-60％。上世纪80年代我国从日本引进温州蜜柑品种，SDV随带毒的接穗和苗木传入我国，该病相继在浙江、四川、湖北、湖南、广西等地发生。 

柑桔花叶病毒(Citrus mosaic virus，CiMV)引起的柑桔花叶病最早发现于日本，病果的果皮部分或整个不着色，同时出现云纹状或轮纹状的斑驳；糖、 酸含量低，没有经济价值。高接在温州蜜柑上的柠檬、金柑的果实也产生斑驳，且与感病温州蜜柑混栽的日本夏橙、伏令夏橙、鸣门柑、代代酸橙、八朔柑等春梢的嫩叶上会产生斑驳、杂色花叶、黄脉以及镶边脉等症状。 

CiMV是SDV的分离株，两者具有亲缘关系。传统的柑桔病毒病检测方法主要是指示植物鉴定，夏代代、香橼、柠檬等鉴定SDV，枸头橙、马叙葡萄柚、白芝麻等鉴定CiMV，虽然指示植物进行病毒病鉴定沿用至今，但烦琐耗时。目前也有检测SDV和CiMV的ELISA检测方法，虽然应用免疫学方法检出速度快，但特异性和灵敏度相对比较差。 

实时荧光定量PCR(Real-time PCR)技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。与目前使用的生物学鉴定，血清学检测和PCR等检测技术相比，实时荧光RT-PCR法具有快速、灵敏和准确的特点，较普通RT-PCR的灵敏度高出10-100倍，而且能对病原体的数量进行精确定量。SYBR Green I染料法具有灵敏度高、信噪比高、适用范围广和低价等特点。在核酸的实时检测方面有很多优点，由于它与所有的双链DNA相结合，不必因为模板不同而特别定制，因此设计的程序通用性好，且价格相对较低。并且普通RT-PCR技术一次只能检测一种病原物，如果反应体系中含有两种以上的病原物，则需多次进行PCR，不但操作复杂，而且费用较高。目前已建立了SDV和CiMV的单一RT-PCR分子检测技术，但尚未见2种病害同时检测的实时荧光RT-PCR体系的报道。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速、灵敏、准确的能同时检测CiMV和SDV 的实时荧光RT-PCR检测试剂盒及方法，适合田间样品的大规模测定和茎尖嫁接脱毒苗的快速评价。 

本发明解决其技术问题采用的技术方案：一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测试剂盒，主要包括特异性引物以及PCR反应试剂，所述特异性引物序列如下： 

上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’； 

下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。 

本发明还涉及一种同时检测CiMV和SDV的实时荧光RT-PCR检测方法，所述方法包括： 

(1)提取柑桔待测样品总RNA； 

(2)样品总RNA经反转录获得其cDNA； 

(3)以样品cDNA为模板，加入特异性引物和PCR反应试剂，进行实时荧光RT-PCR检测，根据Ct值诊断是否含有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；所述特异性引物核苷酸序列如下： 

上游引物：5’-CCGCTTAAGAGTGGCATTAGGT-3’； 

下游引物：5’-TCCTGGATCGGAAAGGGAAGAG-3’。 

根据Ct值进行判断，当Ct值≤35时，样品判断为阳性，带有CiMV和SDV或者两种病毒中的一种；当Ct值>35时，样品判断为阴性，不带CiMV和SDV。 

所述CiMV或SDV特异性引物实时荧光RT-PCR扩增产物大小为160bp。