[发明专利]F9基因拷贝数变异检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，应用于生物科学研究和临床分子诊断，具体涉及一种F9基因拷贝数变异检测试剂盒。

背景技术

血友病B（HB）是临床常见的一种遗传性出血疾病，主要由F9基因突变导致凝血因子IX（FIX）质或量的缺陷而引起体内凝血功能的异常，在男性中的发病率约为1/30,000。根据血浆中FIX活性，HB可分为轻型（>5%）、中型（1-5%）和重型（<1%）三种类型。重型患者表现为自发性关节出血，肌肉出血和内脏器官出血等，轻型患者表现为外伤后出血难止。因此，该病具有高致残率和致死率。替代治疗是目前唯一有效的治疗方法，制剂主要包括凝血酶原复合物（PCC）和重组凝血因子IX（rFIX)。由于缺乏根治措施，通过携带者诊断和产前诊断避免血友病胎儿的出生，对提高人口素质，减轻社会负担具有重要的意义。然而，前提是需要先对家系中血友病B患者进行准确有效的基因诊断。

F9基因位于X染色体长臂27.1-27.2，全长32.7kb，包括8个外显子和7个内含子及其侧翼调控区域。遗传方式为X连锁隐性遗传病，先证者同胞患病风险决定于母亲是否为致病基因携带者，携带者女性的男性后代患病风险为50%，女性后代携带致病基因的风险也为50%。男性患者的女性后代100%为携带者，而男性后代100%为正常。目前已报道的F9基因突变类型广泛，包括有点突变、缺失、插入、重复等。随着基因体外扩增技术的出现和发展，通过患者外周血有核细胞DNA进行F9基因分析已经成为当前进行F9基因诊断的主要手段。简单来说，针对F9的8个外显子及其侧翼序列区域分别设计PCR引物进行体外扩增，然后将PCR扩增产物进行直接测序，通过将测序结果与参考序列比对，查找可能的致病突变。这种直接测序的方法可以检测错义突变、剪接位点突变、无义突变及小缺失和小插入等突变。当家系中先证者的突变位点明确后，对于女性家系成员进行的携带者检测只需扩增相应突变位点所在的外显子，测序比对是否存在相同的突变。如果该女性为携带者，那么相应位点为杂合突变。女性携带者怀孕后，为了避免患儿的出生，怀孕16-22周时需要抽取胎儿羊水进行DNA抽提，直接扩增胎儿羊水DNA的相应突变位点所在外显子，测序比对后查找胎儿是否存在相同的突变。除了直接测序法查找致病突变外，我们还会对家系成员进行基因连锁分析，以对携带者检测和产前诊断结果进行核实。基因连锁分析并不是直接检测致病基因的异常，而是利用与致病基因紧密连锁和共同传递的一系列基因组遗传多态性标记，通过检测家系先证者，明确与致病基因相关的这些遗传标记的特点，进而对家系中其他成员的遗传标记进行检测协助诊断。经过前期工作的筛选后，我们选择了F9 基因外的6个STR位点（DXS1192、DXS1211、DXS8094、DXS8013、DXS1227、DXS102）用于F9基因的遗传连锁分析。然而由于遗传连锁分析属于间诊断方法，且容易受到染色体同源重组等因素的影响，不能得到完全可靠的结果，所以需要与常规测序方法的结果相互验证以取得更加可信的诊断结论。

利用常规直接测序方法可使绝大部分的血友病B家系能得到明确诊断。但据血友病B突变数据库统计，大缺失或重复突变占总F9基因突变类型的5%左右，直接测序的方法不能给与明确诊断，甚至漏诊。首先，当先证者存在大片段缺失时，由于缺失而使得PCR扩增失败。而对于女性家系成员来说，由于存在另外一条正常的染色体模板，PCR扩增是能够成功的，测序结果也是正常的，但不能排除携带者的可能性。其次，当先证者为大片段重复时，PCR能够成功扩增所有外显子区域，但是测序比对不能发现重复突变。此时，对相应外显子的拷贝数进行定量能够明确。基因大片段缺失和重复又称为基因拷贝数变异（CNVs）。随着微阵列CNV芯片技术以及二代测序技术的发展及应用，发现拷贝数变异（CNVs）广泛地存在于人类染色体基因组中。CNVs主要由基因组发生重组而导致，一般指长度为几kb-几Mb基因组大片段的拷贝数增加或者减少，主要表现为亚显微水平的重复，缺失和插入等。通过拷贝数检测方法对先证者F9各外显子的拷贝数进行检测，如果相应外显子缺失，则拷贝数结果为0；如果相应外显子重复，则拷贝数结果大于1。而对于携带者来说，如果缺失拷贝数结果为1，而重复的话拷贝数结果将大于2。但是目前针对CNVs的检测方法非常多，选择合适的技术用于F9基因检测极为重要。