[发明专利]同步检测苹果属上三种检疫性疫霉的四重PCR引物及其扩增方法

说明书

技术领域

本发明设计PCR技术检测寄生于苹果属水果中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法和用途，属于苹果属冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病菌检测领域。

背景技术

苹果属（Malus Mill.）是蔷薇科中经济价值较高的植物，包括如苹果、垂丝海棠、山定子、湖北海棠、西府海棠等是重要的园林树种，在北温带，亚洲、欧洲以及北美洲均有分布。苹果是世界上五大果树（柑橘、苹果、香蕉、葡萄、梨）之一，目前，苹果生产已成为许多国家主要的农事活动，全球约有80多个国家和地区从事苹果生产，年产量超过或接近100万吨的主产国有12个，按产量排，依次为中国（46%）、美国（9%）、土耳其（6%）、意大利（5%）、法国（5%）、波兰（5%）、德国（3%）俄罗斯（3%）等。我国是世界上最大的苹果生产国和消费国，苹果种植面积和产量均占世界总量的40%以上，在世界苹果产业中占有重要地位。

疫霉属（phytophthora spp）真菌是苹果属果树上一类非常重要的病害，常多种疫霉侵染柑橘属果树，复合侵染现象十分严重，侵染后出现脚腐、根腐、冠腐（流胶现象）、果腐和叶疫等多种病害，为害植株的根、颈、叶、花、果实，具有流行性和毁灭性，可导致植物大量减产，甚至绝产、死亡，给柑橘生产带来很大损失。据报道，全世界为害苹果的疫霉约9种，不同国家或不同地区，疫霉种有所不同。其中冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉侵染苹果是我国植物检疫性病原菌，目前在我国尚未发生。冬生疫霉是在澳大利亚西部的柑橘果实上首次发现的，随后在美国、法国等多个国家和地区均有报道。该病菌主要为害柑橘属（Citrus L.）植物，引起果实褐腐。还可以侵染苹果（Malus pumola Mill.）、玫瑰(Rosa rugosa)等，造成枯萎、根腐或溃疡。丁香疫霉2007年被列入我国进境植物检疫性有害生物名单，2011年国内首次截获。丁香疫霉可引起寄主的根、茎、叶、果实的多种病害，可引起苹果的果腐病（fruit rot）和颈腐病（collar rot），丁香疫霉仅在欧洲西北部为苹果的主要病原,引起裙腐,但造成严重损失的是引起贮藏期果实腐烂。受感染的植株长势衰弱，出现茎枯，叶片褪绿萎蔫，严重时整株死亡，果实产量减少和品质下降。栗黑水疫霉寄主范围广泛，主要引起栗树黑水病，侵染树干基部和较大的根，引起树干和根腐烂，还在许多果树上引起根、茎腐烂病。

苹果是世界上最重要的水果之一，在国际农产品贸易中占有非常重要的地位，随着苹果的大量进口，有害生物随之传入我国风险很大。因此，急需加强进境苹果上携带有害生物快速、准确的检测鉴定，有效保护和促进我国苹果产业健康发展。冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的常规生物学检测方法是形态学鉴定，通过分离培养观察真菌病害菌落、分生孢子器、分生孢子等的形状、颜色进行鉴定。由于冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉病菌形态鉴定费力耗时，且较难准确、快速、有效鉴定三种病原菌，易造成漏检和误检，不能满足口岸“快验快放”的要求，导致病菌在我国传播。目前常规检疫方法是根据病原菌形态特征、生物学特性等方面存在的差异进行水果带菌检测。迄今，针对丁香疫霉与近似种检测鉴定的研究不多，目前可行的方法仍是依据形态学来区分丁香疫霉及其近似种，而疫霉的分离纯化比较困难，有性态和无性态形态特征的测定需要 20d 以上的时间，且疫霉的形态特征变化较大，此种情况下不仅耗时费力，且很难根据菌落形态准确、快速、有效地鉴定出两种病原菌，从而造成检疫人员的漏检和误检，且不能满足口岸“快验快放”的要求，从而错过病害最佳防治时期，导致病害在田间肆虐发展。因此，加强对口岸进境柑橘携带有害生物快速、准确的检测显得极为重要，对保护和促进我国柑橘产业健康发展具有十分重要的现实意义。

发明内容

本发明索要解决的技术问题是：设计同步检测苹果属水果上冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，包括冬生疫霉的特异性引物、丁香疫霉的特异性引物和栗黑水疫霉的特异性引物，与自行设计的通用引物18SF/18SR，建立同步检测柑橘属上冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物及其扩增方法和用途。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种同步检测冬生疫霉、丁香疫霉和栗黑水疫霉的四重PCR引物，实现三种检疫性真菌病害同步分子检测的特异引物，序列如下：

冬生疫霉的特异引物：

PHSF：CTT TGC TCG AAA AGC ATA ATG GAA

PHSR：CCA CTC TAC TTC ACA CAA CAT CCT