[发明专利]一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用原生质体技术纯化食用菌菌种的方法。

背景技术

目前，随着食用菌产业规模的日益扩大，对食用菌菌种质量的要求也日益提高。“菌种纯度”是影响菌种质量的一个关键因素。

食用菌菌种是指生长在适宜培养基质上具有结实性的菌丝培养物，菌丝一般为多细胞结构，因此菌种是由许多菌丝细胞组成的细胞群体。

食用菌菌种在继代培养和保藏过程中，由于其自身的碱基突变、转座子、准性生殖等生物学机制，会导致菌种中各个细胞在遗传和表型上的不一致性，也就是说菌种纯度降低，或菌种不纯。

不纯的菌种在生产上会导致生长不一致、出菇不整齐、子实体商品性状杂乱、产量降低、栽培周期延长等诸多问题，这些问题在工厂化栽培中表现尤为严重。

为了恢复或提高菌种的纯度，目前生产中通常利用子实体组织分离技术、孢子分离杂交、继代培养筛选等方法。子实体组织分离技术和继代培养筛选获得的菌种仍然来源于多细胞群体，只能是在一定程度上提高菌种纯度，仍然不纯。孢子分离技术虽然能获得纯菌种，但是有性孢子形成过程中经历一次染色体重组，其性状会发生较大的变异。

发明内容

本发明的目的是提供一种食用菌菌种纯化方法。

本发明提供的食用菌菌种纯化方法，依次包括如下步骤：

(1)取食用菌的出发菌株，制备原生质体；

(2)进行原生质体再生，得到原生质体再生菌；

(3)进行如下(a)和/或(b)：

(a)检测各个原生质体再生菌的培养特性，菌丝生长速率的一致性高的原生质体再生菌即为纯化后的菌种；

(b)检测各个原生质体再生菌的出菇特性，子实体产量的一致性高的原生质体再生菌即为纯化后的菌种。

所述(a)具体可为：检测各个原生质体再生菌的菌丝生长速率，菌丝生长速率的一致性高于所述出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种；

所述(b)具体可为：检测各个原生质体再生菌的子实体产量，子实体产量的一致性高于所述出发菌株的原生质体再生菌即为纯化后的菌种。

所述“制备原生质体”的方法具体包括如下步骤：①将所述出发菌株接种到PDB培养基，25℃培养5-10d；②完成步骤①后，收集菌丝体，用0.6M甘露醇水溶液洗涤，然后用无菌滤纸吸干菌丝体表面的溶液；③取0.1g步骤②得到的菌丝体，加入0.8ml溶壁酶溶液，30℃反应4h；④完成步骤③后，在无菌条件下用无菌脱脂棉滤芯过滤，收集滤液，即为含有原生质体的溶液。所述PDB培养基的组成具体如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000ml，自然pH。所述溶壁酶溶液的制备方法具体如下：将0.4g溶壁酶(广东省微生物菌种保藏中心，http://www.gimcc.net/prolist.asp)溶于10ml0.6M甘露醇水溶液，用0.22μm无菌过滤器过滤除菌。

所述“进行原生质体再生”的方法包括如下步骤：①取原生质体溶液，涂布到再生培养基，25℃培养5-6天；②完成步骤①后，挑取菌落，接种至PDA试管培养基，25℃培养6-10天(如6-7天或8-10天)；③完成步骤②后，取双核菌株，即为原生质体再生菌。所述原生质体溶液具体可为原生质体浓度为10⁶个/ml的原生质体溶液。所述再生培养基的组成具体如下：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、甘露醇109g、水1000ml，自然pH。

所述食用菌可为杏鲍菇或平菇，具体可为杏鲍菇ACCC52627或平菇ACCC50838。

本发明还保护以上任一所述方法在食用菌生产中的应用。所述应用中，选择菌丝生长速率高于所述出发菌株的原生质体再生菌和/或子实体产量高于所述出发菌株的原生质体再生菌进行生产。

食用菌菌种是多细胞的菌丝组成的。利用原生质体制备可以分离获得单细胞，单细胞的原生质体再生可以重新萌发形成菌种。原生质体再生菌种的所有细胞都起源于同一个原生质体细胞，所以这些细胞的遗传和表型一致，也就是说单细胞原生质体再生获得的菌株是遗传上高度一致的纯菌种。另外，利用原生质体纯化菌种的过程中未经历有性过程和染色体重组，所以最大程度上保留了菌种原有的农艺性状和商品性状。