[发明专利]利用大肠杆菌产γ-谷氨酰甲胺合成酶高效生产L-茶氨酸的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用大肠杆菌基因工程菌生产的γ-谷氨酰甲胺合成酶来催化合成L-茶氨酸的方法。

背景技术

茶氨酸（N-乙基-γ-谷氨酰胺）是茶叶特有的一种氨基酸，也是茶叶的呈味物质之一，其含量直接决定着茶叶的品质。同时，茶氨酸具有放松神经、抗抑郁、抗肿瘤、降血压、提高免疫力等医药作用，也可以应用与食品领域、如作为功能食品的添加剂等。因此越来越受到人们的重视，国内外市场需求量不断增大。

目前，茶氨酸的生产方法，主要有三种。一种是从茶叶中提取。茶叶中茶氨酸含量低，而且原料来源受限，茶氨酸产量很低，最终导致生产成本过高。第二种方法，便是化学合成的方法。该方法会导致毒性物质残留，而且生成物中会形成D、L-型茶氨酸异构体，拆分精制工艺复杂。第三种是利用微生物酶法生产L-茶氨酸。目前，专利和文献所报道的生产茶氨酸的酶主要是谷氨酰胺酶（CN1688705A,2005;JP2007185132A）、γ-谷氨酰转肽酶（CN101343618A,2008;茶叶科学，2007,27（1），61-66；食品工业科技，2008,29（2）166-169）或者谷氨酰胺合成酶等，反应底物为谷氨酰胺和乙胺，与化学合成法相比，不会产生消旋现象，转化率高，反应条件温和。已受到了广泛研究，并已进入工业化应用领域。然而未见利用基因工程来源的γ-谷氨酰甲胺合成酶为催化剂，以更低成本的谷氨酸和乙胺为底物，高效酶法制备茶氨酸的文献报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高效转化谷氨酸和乙胺合成茶氨酸的大肠杆菌菌种，以及该菌种在制备L-茶氨酸中的应用。

本发明的技术方案如下：

总体技术方案是自然环境土壤细菌基因组DNA的提取，γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的克隆，采用合适的表达载体和限制性内切酶，构建重组表达载体，将γ-谷氨酰甲胺合成酶基因克隆到合适的宿主细胞，包括但不限于大肠杆菌。

1. 自然环境土壤细菌基因组DNA的提取:在多处茶树根际取样，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂盒方法提取土壤环境微生物DNA。

2. γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的克隆: 根据γ-谷氨酰甲胺合成酶基因的保守序列，设计引物，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂配制方法，通过PCR扩增γ-谷氨酰甲胺合成酶基因。

3. 表达载体的构建、转化和转化子筛选：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、完全可与从商业途径获得的载体、限制性内切酶和方法，将目标基因克隆到载体，转化宿主细胞，筛选转化子。

4. 重组菌的摇瓶发酵：按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，进行摇瓶发酵，利用SDS-PAGE分析蛋白表达情况。

5.   茶氨酸酶法转化合成工艺:根据酶本身的活性特征，按照本领域一般技术人员熟悉的步骤、试剂、方法，进行酶法转化合成实验，参考文献报道，利用液相检测茶氨酸的合成情况。

发明效果

本发明的有益效果体现在，通过构建高效表达γ-谷氨酰甲胺合成酶的大肠杆菌工程菌，在有效获得高产量重组酶的同时，能有效利用谷氨酸和乙胺合成L-茶氨酸，且转化率在70%左右，为今后充分利用低成本的谷氨酸工业化成产L-茶氨酸提供了有效的生产菌株。

 附图说明

图1重组质粒（pET-GMAS）图谱

图2 SDS-PAGE凝胶电泳图谱

附序列 γ-谷氨酰甲胺合成酶基因核苷酸序列。

具体实施方式

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α、BL21（DE3）菌株及质粒载体pMD18-T simple vector,pET28a均为本实验室保藏。

1.2试剂和材料