[发明专利]口腔鳞状癌诊断试剂盒及MYH7基因在其制备中的用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种口腔鳞状癌诊断试剂盒及MYH7基因在制备口腔鳞状癌诊断试剂盒中的应用。

背景技术

在我国，口腔颌面部的恶性肿瘤以癌为最常见，肉瘤较少。在癌瘤中又以鳞状细胞癌为最多见，一般占80％以上。口腔鳞状细胞癌(Oral Cancer)的发生是个多因素、多步骤、多阶段的复杂过程，在这些过程中，涉及众多基因表达的改变，导致细胞正常生理过程及大分子代谢紊乱，信号转导受阻，细胞结构改变及免疫调节紊乱等，结果导致细胞异常增殖，最终形成癌。与口腔鳞状细胞癌发病相关的因素既包括各种理化刺激、致瘤性病毒等外源性因素，又包括机体的免疫状态、遗传易感性以及DNA损伤修复能力等内源性因素。在口腔鳞状细胞癌的发生过程中最重要的机制是细胞中原癌基因激活和抑癌基因失活，最终导致细胞增殖和(或)凋亡调节失控。

高通量转录组测序(RNA-sep)是在转录组水平上进行深度测序的一项技术，测序技术在转录组分析中的应用主要集中在基因表达谱的构建、新基因的发现、小分子非编码RNA表达谱的构建和新小分子RNA基因的发现、蛋白质编码基因注释、以及如fusion transcript等转录组研究上。数据在最初的处理上是大体是相似的，接下来针对不同的研究目的可以选用不同的生物信息学软件进行计算。

利用大规模测序技术直接对由mRNA反转录成的cDNA序列进行测序，产生数以千万计的reads数量，从而使得一段特殊的基因组区域的转录水平可以直接通过比对到该基因组区域的reads数来衡量。该技术常用来构建某一特定组织或细胞的基因表达谱，通过对正常组织和病变组织进行基因表达谱的分析，得到在两种组织中差异表达的基因，一方面为研究疾病的发生和发展的分子机制提供新的思路，另一方面为疾病的诊断和治疗提供新的诊断标记物或新的药物靶点。

利用高通量转录组测序筛选与口腔鳞状细胞癌密切相关的基因，不仅有利于研究口腔鳞状细胞癌的发生和发展的病理机制，而且为诊断和治疗口腔鳞状细胞癌提供新的诊断标志物或新的药物靶点。

发明内容

本发明利用高通量测序技术发现MYH7基因在口腔鳞状癌组织中的表达与在正常组织中的表达存在差异，与正常组织相比，MYH7基因在口腔鳞状癌组织中表达下调，通过检测MYH7基因转录水平的表达情况，可以判断受试者是否患有口腔鳞状癌。

本发明的目的在于提供MYH7基因在制备诊断口腔鳞状癌的试剂盒中的用途。所述诊断试剂盒包含SYBR Green聚合酶链式反应体系、用于扩增MYH7基因和管家基因的引物对。SYBR Green聚合酶链式反应体系包含PCR缓冲液、dNTPs、SYBR Green荧光染料。

上述技术方案中，PCR缓冲液为本领域技术人员公知的现有技术，优选地，PCR缓冲液包含：25mM KCl，2.5mM MgCl₂，200mM(NH₄)₂SO₄。

引物对是本领域技术人员可以根据引物设计的常规设计原则设计；优选的实施方案中，扩增MYH7基因的正向引物序列为5’-ATGGACCTGGAGAATGAC-3’，反向引物序列为5’-CAATCCTTGCGTTGAGAG-3’；管家基因优选GAPDH，扩增该基因的正向引物序列为5’-TTTAACTCTGGTAAAGTGGATAT-3’，反向引物序列为5’-GGTGGAATCATATTGGAACA-3’。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含M-MLV逆转录体系，该逆转录体系包含：T重复寡核苷酸Oligo(dT)、逆转录反应液、M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、dNTPs。

优选逆转录反应液包含：250mM PH8.3的Tris-HCL，375mM的KCL，15mM的MgCl₂，50mM的DTT。

RNA酶抑制剂可选用本领域常用的RNA酶抑制剂，优选为大肠杆菌表达的非竞争性抑制RNA酶的重组蛋白酶。

在本发明的一个具体的实施方案中，本发明的诊断试剂盒还包含RNA提取试剂，RNA酶提取试剂包含Trizol、氯仿、异丙醇、75％乙醇。

本发明的诊断试剂盒保存于-20℃，尽量减少反复冻融。