[发明专利]一种基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种检测ESR1基因突变的方法。

背景技术

人类雌激素受体α(Estrogen receptor alpha,ESRα)由ESR1(Estrogen Receptor1)基因编码。ESRα与其配体雌激素结合后，可激活细胞内一系列的细胞生物学效应。ESR1基因的突变和异常表达均与乳腺癌等疾病的发生有关。

ESR1基因最为常见的突变类型为Y537S,Y537C,Y537N以及D538G。这些突变使得ESRα的构象改变，其可在不与雌激素结合的情况，表现为持续性激活状态。

目前已报道的应用于检测ESR1突变的方法的为直接测序技术和二代测序技术。其中直接测序技术成本低，准确性高，然而需要PCR后处理步骤，既操作复杂，又容易发生污染，产生假性结果；且该方法灵敏度不足，不能完全适应临床样本的复杂情况。二代测序技术灵敏度高，但其依赖于昂贵的仪器和分析软件，检测成本大大增加，难以作为普适技术。

等位基因特异性PCR(Allele-specific PCR)，也称为ARMS(Amplification Refractory Mutation System)技术，是一种利用序列特异性引物对模板进行选择性扩增而达到检测基因突变的方法。其核心原理是根据PCR过程中DNA聚合酶引导的引物延伸从引物的3′末端开始，而引物3′末端的碱基与模板的互补配对程度强烈影响聚合酶的识别作用和PCR反应的进行:若这个碱基与模板正常互补配对(A-T,G-C)，则引物可以不间断延伸，PCR得以高效进行，得到完整的产物；反之，若这个碱基与模板非正常配对，则引物的延伸受到阻滞，PCR效率大大降低。故将与突变位点对应的碱基放置在引物的3′末端，同时在必要时人为引入其他碱基的错位配对，便可以达到选择性扩增某种等位基因的作用。将ARMS技术与以TaqMan探针为基础的荧光PCR结合起来，便可以达到快速准确检测基因突变的目的。

发明内容

为了克服传统检测技术的缺陷，本发明提供一种基于荧光PCR快速准确检测ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G四种突变的方法，即通过设计等位基因特异性引物，结合TaqMan探针技术，在一个反应中快速准确检测ESR1基因突变。

为实现以上发明目的，本发明的基本技术方案如下：

基于荧光PCR技术检测ESR1基因突变的方法，用于非疾病诊断目的，包括以下环节：

(1)引物及荧光探针设计：

针对ESR1基因Y537S,Y537C,Y537N以及D538G这四种突变分别设计等位基因特异性引物，均作为上游引物，序列如下:

Y537S:5’-GAACGTGGTGCCCCTCcC-3’

Y537C:5’-GAACGTGGTGCCCCTgTG-3’

Y537N:5’-AGAACGTGGTGCCCCaCA-3’

D538G:5’-ACGTGGTGCCCCTCTATtG-3’

其中小写字母表示的碱基为人为引入的错配，以增强检测的特异性；

针对四种突变设计一条共通的下游引物，序列如下:

Rp:5’-CACGGCTAGTGGGCGC-3’

针对四种突变设计一条共通的TaqMan荧光探针，其序列及修饰如下:

Probe:5’-FAM-CTGGAGATGCTGGACGCCCAC-BHQ2-3’

针对ALB基因设计的序列特异性引物探针组合，作为内质控体系，其序列如下:

ALB Fp(上游引物):5’-TGTTGCATGAGAAAACGCCA-3’

ALB Rp(下游引物):5’-GTCGCCTGTTCACCAAGGAT-3’

ALB Probe(探针):5’-HEX-AGTGACAGAGTCACCAAATGCTGCACA-BHQ2-3’

其中，FAM为6-carboxyfluorescein；HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein；BHQ2为Black Hole Quencher-2；

(2)模板的制备:提取待测样本的基因组DNA；

(3)建立荧光实时定量PCR反应体系：