[发明专利]利用组织培养法生产苹果类黄酮

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及植物生物技术领域，具体涉及利用组织培养法生产苹果类黄酮。

背景技术

“医食同源”是发展方向。类黄酮是苹果果实中的一类主要多酚类物质，对人体健康具有多方面的生理功能；而苹果是世界性果品，由于其生态适应性强、果品营养价值高、耐贮性好及供应周期长，世界上相当多的国家都将其列为主要消费果品而大力推荐；我国是世界上最大的苹果生产和消费国，其中2012年生产苹果3950万吨，主要用于鲜食，且近70％是类黄酮含量较低的‘红富士’品种。因此，为保证消费者从苹果中摄取足够的多酚和类黄酮，有效利用我国新疆野苹果资源，进一步培育并推广类黄酮含量高的功能型苹果新品种，研究建立利用愈伤组织生产苹果类黄酮的离体组织培养技术体系，对于新疆野苹果资源的科学保护与持续利用、推动我国苹果产业的优质高效发展及人类的健康具有重要意义。

新疆野苹果及其红肉变型(Malus sieversii f.neidzwetzkyana)是世界栽培苹果的祖先种，不仅遗传多样性丰富，而且果实多酚及Ca等功能成分含量均是‘红星’苹果品种的3倍以上，是苹果品质育种的重要资源。但由于农田开垦等原因，新疆野苹果资源正遭到严重破坏，濒临灭绝；为此，研究人员在对新疆野苹果资源遗传多样性评价研究的基础上，于2006年在国内率先构建了‘红富士’苹果品种×新疆红肉苹果的F1杂种分离群体；近期的研究发现，F1群体出现了红/绵肉、红/脆肉、白/绵肉及白/脆肉株系的分离现象，从杂种F1代群体中能够选育出果个较大、鲜食品质较好、抗氧化能力强、类黄酮含量高的红肉脆肉株系，并选出了红脆1～10号。以此为技术依托，提出了“功能型苹果”的概念(在果实中富含类黄酮、可鲜食或加工的保健型苹果)，申报了鲜食类功能型苹果“三选两早一促”的育种法发明专利。

除了上述果个较大的红肉脆肉株系外，从杂种F1代群体中还能选育出果个较小(单果重20-40g)、分离比例极低、鲜食品质较差或很差、但类黄酮含量很高、果肉全红、枝、叶、花均为紫红色的紫红1～3号(见图1)；要以果个小、鲜食品质差的紫红1～3号为杂交亲本，育成果个大、鲜食品质优良的功能型苹果新品种比较困难。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种利用组织培养法制备类黄酮含量高的苹果愈伤组织的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：

1)将R6R6基因型苹果外植体在愈伤组织诱导培养基中诱导培养，得到愈伤组织；

2)将所述愈伤组织在继代培养基中继代培养，得到继代愈伤组织；

3)将所述继代愈伤组织在增强培养基中增强培养，得到增强后愈伤组织，即为类黄酮含量高的苹果愈伤组织。

上述方法中，所述愈伤组织诱导培养基由终浓度为2.5mg/L2,4-D、0.5mg/L6-BA、0.1mg/L KT、MS液体培养基(表1所示各组分及其终浓度，为有N的)、凝固剂和水组成；

所述继代培养基由终浓度为0.3mg/L NAA、1.0mg/L6-BA、MS液体培养基(表1所示各组分及其终浓度，为有N的)、凝固剂和水组成；

所述增强培养基由无N MS培养基、终浓度为0.3mg/L的NAA、终浓度为1.0mg/L的6-BA、水和凝固剂组成。

所述无N MS培养基由表4所示的终浓度的各组分和水组成。

上述方法中，所述凝固剂为为琼脂，所述凝固剂在其所在的培养基中的终浓度均为7g/L。

上述方法中，所述诱导培养的条件为先24℃暗培养2周，再光周期为16/8h培养2～3周，光照强度50umol m^-2s^-1；

所述继代培养的条件为24℃、16/8h、光照强度50umol m^-2s^-1、培养2周；

所述增强培养的条件为：24℃、16/8h、光照强度50umol m^-2s^-1、培养15天。

上述方法中，所述类黄酮含量高的苹果愈伤组织为类黄酮含量高于10mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于15mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于20mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于25mg/g的苹果愈伤组织或类黄酮含量高于28mg/g的苹果愈伤组织。

上述方法中，所述R6R6基因型苹果为以新疆红肉苹果为父本，红富士苹果为母本进行杂交，得到R6R6基因型的杂交子代苹果；