[发明专利]用于鉴定布鲁氏菌自然感染或免疫接种家畜的方法

说明书

技术领域

本发明涉及蛋白质组学，具体地说，涉及一种用于鉴定布鲁氏菌自然感染或免疫接种家畜的方法。

背景技术

布鲁氏菌(Brucella，简称布氏菌)是一种革兰染色阴性的兼性细胞内寄生菌，是布鲁氏菌病(Brucellosis，简称布病)的病原菌。布病是一种人兽共患病，在我国传染病防治法中属于乙类传染病。国际上，布病被归为B类传染病，在世界范围内都有流行，特别是2000年以后，布病疫情大幅度上升，给人民群众带来严重的健康损害和经济损失。

目前，布鲁氏菌诊断的金标准是细菌分离培养，但是，布鲁氏菌培养难度大，周期长，且分离率低。最常用的血清学检测方法为虎红平板凝集试验(RBPT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)等，另外，由布鲁氏菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)包被的ELISA检测方法也逐步用于布病的诊断。但以上方法均无法区别试管凝集阳性血清是由于疫苗免疫还是自然感染。随着基因组学和蛋白质组学的发展，许多科研人员着眼于寻找布鲁氏菌疫苗株与野毒株的差异蛋白，并且进行了大量研究，但是目前为止，并没有找到一个能够从本质上区别疫苗株与野毒株的理想方法。

人间布病的防控与动物布病的防控密不可分，而且研究数据显示人间布病的流行趋势与动物布病的流行趋势相符。在我国，牛和羊是布病主要的传染源，因此，控制牛和羊的布病疫情，有利于控制人间布病的流行，对减少国家和人民的经济损失具有重大意义。家畜布病预防的主要措施之一是疫苗的免疫接种。但是，由于传统的检测方法无法区别家畜的自然感染和免疫接种，如果将布病病畜误以为是免疫家畜，会保存传染源，对人和健康家畜带来极大威胁，反之，若将免疫家畜误以为是布病疫畜而淘汰宰杀，会对国家及个人经济带来巨大损失。特别是牛作为一种布病常见传染源，且其经济价值较高，所以，在目前疫情极其严重时期，更加需要一种方法能够区别出牛是自然感染还是免疫接种，并据此采取科学的处理措施，最大程度的避免不必要的经济损失，同时鉴别染疫动物保护人及其他家畜的健康。

目前，我国最普遍应用于牛的疫苗是M5和S2，分别是羊种和猪种布鲁氏菌的弱毒活疫苗株，而自然感染的病牛，主要是牛种布鲁氏菌。随着布鲁氏菌全基因组测序技术的发展，已经有报道bp26基因存在于所有布鲁氏菌种中，而且种间相当保守，而omp31基因存在于除牛种之外的所有布鲁氏菌中，所以，将Bp26蛋白作为阳性对照蛋白，而Omp31蛋白作为种间差异标识蛋白，可有效地将牛种布鲁氏菌与羊种和猪种等其他布鲁氏菌种从血清学方法上区分开来，进而判断SAT阳性的牛是自然感染还是免疫接种。

发明内容

本发明主要根据家畜免疫接种疫苗株与自然感染的布鲁氏菌种的不同，通过区分布鲁氏菌的种间差异，间接的将疫苗接种与自然感染的家畜区分开来。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于鉴定布鲁氏菌自然感染或免疫接种家畜的方法，其是将Omp31蛋白或含His标签的重组Omp31蛋白作为布鲁氏菌种间差异标识蛋白，且以Bp26蛋白或含His标签的重组Bp26蛋白作为阳性对照蛋白，对于布鲁氏菌感染血清SAT呈阳性的家畜，Bp26蛋白或含His标签的重组Bp26蛋白与不同种的布鲁氏菌感染血清均发生反应，而Omp31蛋白或含His标签的重组Omp31蛋白仅与除牛种布鲁氏菌以外的其它种的布鲁氏菌感染血清发生反应，进而判定SAT呈阳性的家畜为布鲁氏菌自然感染或免疫接种。

其中，所述含His标签的重组Omp31蛋白以及含His标签的重组Bp26蛋白的制备方法为：

1)从NCBI上获取bp26和omp31的基因序列(bp26基因的GenBank编号为AY166768.1，omp31基因的GenBank编号为AF366063.1)，分别设计引物，PCR扩增bp26基因和omp31基因；

2)分别对步骤1)的扩增产物进行酶切，然后将bp26基因片段与经过相同酶切的pET30a质粒连接，将omp31基因片段与经过相同酶切的pET32a质粒连接，分别将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆；

3)将步骤2)中筛选到的阳性克隆分别接种到含相应抗生素的LB液体培养基中，加入诱导剂IPTG进行诱导，将诱导后的菌液离心，收集菌体，加入PBS液重悬菌体，超声破碎后离心，所得沉淀用尿素溶解，离心后收集上清，用孔径0.45μm的滤膜过滤，滤液过His标签蛋白纯化柱，即得含His标签的重组蛋白。

用于PCR扩增bp26基因的引物包括：