[发明专利]一种利用DNA损伤修复机制使单克隆抗体细胞株进行体内快速进化的新方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体为一种利用DNA损伤修复机制对单克隆细胞株进行体内快速进化的新方法。 

背景技术

单克隆抗体(monoclonal antibody，mAb)，简称单抗，是仅由可以制造这种抗体的免疫细胞与癌细胞融合后的杂交瘤细胞产生的。将这种杂交瘤作单个细胞培养，可形成单细胞系，即单克隆。利用培养或小鼠腹腔接种的方法，便能得到大量的、高浓度的、非常均一的抗体，其结构、氨基酸顺序、特异性等都是一致。单克隆抗体可直接用于人类疾病的诊断、预防、治疗以及免疫机制的研究，为人类疾病的免疫诊断与免疫治疗开辟了广阔前景。 

单克隆抗体较多克隆抗体具有如下几个优点。1.杂交瘤实现体外永生化并持续传代，只要不发生细胞株的基因突变，就可以不断地生产高特异性、高均一性的抗体。2.由于可能得到“无限量”的均一性抗体，使得抗体作为药物成为可能。3.可以实现标准化生产，用于以标记抗体为特点的免疫学分析方法。4.由于单克隆抗体的高特异性和单一生物学功能，可用于治疗性药物、放射免疫显像、医学诊断试剂甚至环境污染的检测等广泛领域。单克隆抗体的制备虽然在细节上有各种优化，但是技术框架已经相对成熟。 

人源化/全人源单克隆抗体的设计与开发的技术流程包括靶点选择与验证、针对靶点单抗制备、抗体筛选、抗体基因克隆、抗体人源化、抗体亲和成熟、人抗体制备、动物模型研究和临床试验等。目前，抗体药物研发很多方面还存在较大的发展空间。其中，抗体亲和力和特异性等特性的提升是抗体研发最为关键，也是最容易遭遇技术瓶颈的的步骤。 

抗体库容量的产生机制主要包括组合多样性、连接多样性和体细胞高频突变，而高亲和力抗体是在体细胞高频突变和抗原选择下产生的。B细胞在识别抗原后发生分裂增殖的过程中产生体细胞高频突变，且突变主要集中在重、轻链可变区内决定抗体与抗原亲和力的互补决定区(CDR)。因此，体细胞高频突变能产生高亲和力的抗体，而具有高亲和力抗体的B细胞在低浓度抗原刺激下会优先 活化增殖，逐渐形成高亲和力的B细胞优势细胞群，进一步分泌产生高亲和力抗体。 

抗体库技术是利用分子克隆技术扩增全套抗体重、轻链可变区基因，然后与特定的表达载体连接，转化到宿主细胞中表达出有功能的抗体，并通过亲和筛选等方法筛选到高亲和力的特异性抗体。抗体库技术经历体内和体外发展阶段，其中体内以噬菌体抗体库技术最为常见，体外以核糖体和mRNA抗体库技术最为常见。抗体库方法和技术通过模拟抗体在机体内生成的重要环节，如多样性B细胞群体、克隆选择、亲和力成熟等，加快了抗体制备的速度，降低了生产成本，为快速从大库容量的抗体库中筛选并大规模制备高亲和力特异性抗体提供了简便而高效的操作系统。但是抗体库方法和技术目前仍然存在亟待解决的问题，例如在保证抗体库多样性和呈现效率的同时，如何提高库容量以及抗体产量等问题。而且抗体的轻链可变区对于抗体的稳定性，亲和力非常重要，这就造成现有体外抗体演化技术不可逾越的瓶颈。 

发明内容

针对上述问题，本发明公开了一种我们研发了基于单克隆抗体细胞株的体内抗体进化技术。该方法利用AID突变体及控制其在CDR区的招募情况可以使可变区的突变几率达到10^-3-10^-2/代，可以用于高亲和力抗体快速筛选工艺。 

为达到上述目的，本发明的实施采用如下方案。 

首先在NCBI上查询确定小鼠AID、DDB1和SIRT2基因的标准序列，再根据核酸序列设计相应的扩增引物。将这三个基因通过同源重组的方法克隆至慢病毒骨架载体。AID基因的38位氨基酸通过定点突变方法转换为甘氨酸(AID mutant)。 

进一步的根据三质粒慢病毒系统方法，包装获得病毒上清，再进行转染获得分别转染进Plv-AID、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒，Plv-DDB1和Plv-SIRT2双质粒及三质粒共转的五个稳定的细胞系。 

进一步的通过使用OMEGA公司的RNA提取试剂盒提取Plv-AID mutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒及三质粒共转的细胞系中RNA进行反转获得CDNA。在进一步用PCR的方法检查Plv-AID mutant、Plv-DDB1和Plv-SIRT2单质粒及三质粒共转的细胞系中抗体突变率的变化情况。确定三质粒共转的细胞系中抗体突变进化率最高。