[发明专利]靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程及医药生物领域，具体地说，涉及一种靶向抑制肺癌细胞的基因药物及其制备方法。

背景技术

肺癌(Lung cancer)，是一种源于支气管黏膜或腺体的恶性肿瘤。目前，肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，在多数发达国家位列癌症死因首位，在我国肺癌也是发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中超过80％为非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer，NSCLC)，5年存活率不超过10％。传统治疗方法副作用大，患者的中位存活期(Median Survival Time)不到1年。对于晚期NSCLC患者，无论是放疗或综合治疗，虽然取得了一定的治疗效果，但就其疗效及生存率而言，远不能令人满意。因此，迫切需要探索高效靶向杀灭肺癌细胞的新型药物。

随着分子生物学技术的发展和完善，以及对肺癌发病机制等认识的日益深化，基因治疗作为一种高效性、特异性、靶向性强的治疗方法，越来越受到重视，已成为继放化疗和手术治疗之后极有发展前景的治疗方法。但目前基因治疗存在基因表达效率低，靶向性差的缺点。申请号:201210063812.1和201210064390.X中公开一种以人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)肿瘤特异性启动子，高效靶向肿瘤细胞载体T-VISA(VP16-GAL4-WPRE integrated systemic amplifier,VISA)，并与多个抑癌基因或促凋亡基因(如BikDD、PEA15、miR34等)结合，在高特异性灭杀乳腺癌、前列腺癌及肺癌等体内外实验中均取得良好的效果。

脂质体作为新型基因药物输送载体具有许多优点，当药物被脂质体包裹后，可降低药物毒性，减少药物用量，可进行靶向给药，提高药物疗效。目前市面上商品化的脂质体多为普通脂质体，在某些肿瘤细胞或正常细胞中基本无转染效率，更无法应用于动物体内做转染研究，而且作为载体，目前使用的脂质体靶向分布不理想，稳定性较差。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效特异靶向抑制肺癌细胞的基因治疗药物，可全身给药，效率高，药效确切，毒副作用低，能特异杀灭肺癌细胞。

本发明的另一目的是提供上述基因药物的制备方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种靶向抑制肺癌细胞的基因药物，所述基因药物为纳米脂质体包裹的质粒T-VISA-BikDD。

其中，质粒T-VISA-BikDD的核苷酸序列如Seq ID No.1所示，或Seq ID No.1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白的核苷酸序列。

所述纳米脂质体的制备方法为：将氨基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺按1:2的摩尔比混合，加入有机溶剂溶解，使氨基甲酰基胆固醇的浓度为1.18mg/mL，将上述溶液置于旋转烧瓶中，在60℃水浴中旋转蒸发，得到一层附着于烧瓶内壁上的脂膜；然后加入双蒸水，使氨基甲酰基胆固醇与磷脂酰乙醇胺的摩尔浓度为20mM/L，所得溶液经超声处理5min(采用200w超声波细胞破碎仪，超声5s，间歇5s)，依次通过0.45μm、0.22μm的滤膜，收集通过0.22μm的聚碳酸酯膜滤膜的滤液即得纳米脂质体。可将所述纳米脂质体放入洁净的离心管中，用氮气充填离心管，将脂质体存放于离心管中，置于4℃避光保存。

其中，纳米脂质体的平均粒径为100nm，所述有机溶剂为氯仿与甲醇按等体积比混合配制。所制备的纳米脂质体可体内外高效低毒转染质粒，稳定性好，并具有高效肿瘤靶向的特性，可发挥显著的抗肿瘤作用，用于治疗肝癌、肺癌、胃癌等，应用前景广阔。

本发明靶向抑制肺癌细胞的基因药物的粒径约为150-300nm。平均粒径约为244nm。

本发明还提供所述基因药物的制备方法，将纳米脂质体加入到注射用水中，得到的纳米脂质体溶液中脂质体的浓度为8mM，另将T-VISA-BikDD质粒加入到注射用水中使质粒浓度为0.6μg/μl，然后将纳米脂质体溶液和T-VISA-BikDD质粒溶液混合静置20min，即得。

本发明采用薄膜分散法制备的纳米脂质体，平均直径约为100nm，容许其穿透极细的毛细血管并被细胞摄取。将该纳米脂质体与基因治疗质粒T-VISA-BikDD结合，可达到靶向分布理想、高效、低毒、稳定性好等目的，为临床提供一种高效高特异抑制肿瘤的基因药物。