[发明专利]一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌

权利要求书

1.一株以葡萄糖为底物合成粘康酸的大肠杆菌工程菌，其特征在于，引入了2，3-二羟基苯甲酸至粘康酸的代谢途径，并强化了大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径；所述2，3-DHB至MA的代谢途径通过表达异源2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶来实现；所述强化大肠杆菌自身从葡萄糖到2，3-DHB的代谢途径，通过表达分支酸异构酶、异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶实现，还表达了DAHP合酶基因aroG^fbr与莽草酸激酶基因，以解除苯丙氨酸对同工酶AroG的反馈抑制，并强化莽草酸途径；编码所述2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的基因entX的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码所述邻苯二酚1，2-双加氧酶的基因catA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；编码所述分支酸异构酶的基因entC的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；编码所述异分支酸裂解酶的基因entB的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；编码所述2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的基因entA的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述DAHP合酶基因aroG^fbr的核苷酸序列如SEQID NO.6所示；编码所述莽草酸激酶的基因aroL的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；所述entX和catA以pACYCDuet-1或pETDuet-1为载体进行共表达；所述aroG^fbr和aroL以pCDFDuet-1为载体进行共表达，所述entC、entB、entA以质粒pRSFDuet-1进行共表达。

2.一种构建权利要求1所述大肠杆菌工程菌的方法，其特征在于，是向大肠杆菌中引入2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶和邻苯二酚1，2-双加氧酶的异源代谢途径，催化2，3-二羟基苯甲酸转化成邻苯二酚，最终得到粘康酸；同时强化表达大肠杆菌自身的分支酸异构酶、异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶，并表达DAHP合酶基因aroG^fbr与莽草酸激酶基因aroL，解除苯丙氨酸对aroG的反馈抑制。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：

(1)将核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的2，3-二羟基苯甲酸脱羧酶的entX基因与核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因catA在质粒pACYCDuet-1和pETDuet-1上共表达，分别得到pACYC-XA或pET-XA；

(2)将大肠杆菌自身的分支酸异构酶的entC基因与异分支酸裂解酶、2,3-二氢-2,3-二羟基苯甲酸脱氢酶的entBA基因在质粒pRSFDuet-1上共表达，得到pRSF-CBA；

(3)将解除苯丙氨酸反馈抑制的DAHP合酶基因aroG^fbr与莽草酸激酶基因aroL在质粒pCDFDuet-1上共表达，得到pCDF-GL；

(4)将pACYC-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu1；

(5)将pET-XA、pRSF-CBA、pCDF-GL同时导入大肠杆菌BL21(DE3)，得到重组菌Mu2。

4.一种应用权利要求1所述大肠杆菌工程菌发酵生产粘康酸的方法。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，将大肠杆菌工程菌活化后转接到发酵培养基中，并添加相应的抗生素，以180rpm-300rpm的转速在37℃培养到OD₆₀₀为0.4-1.5，然后加入终浓度为0.1-1.0mM的IPTG，于25-37℃继续培养96h。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基为无机盐培养基，组成为g/L：MgSO₄·7H₂O 0.1-0.4，CaCl₂·2H₂O 0.015-0.045，KH₂PO₄ 3.5-4.5,K₂HPO₄ 12.5-20.0，NaCl 0.5-3.0，(NH₄)₂SO₄3.0-6.0，盐酸硫胺素0.0125-0.0325，2，3-DHB 0.001-0.05，微量元素母液，葡萄糖终浓度1.0-5.0，甘油终浓度1.0-10.0；所述微量元素母液的组成为g/L：Al₂(SO₄)₃·18H₂O 2.0-4.0，CoCl₂·6H₂O 0.05-0.20，CuSO₄·5H₂O 0.10-0.45，H₃BO₃ 1.25-2.00，MnCl₂·4H₂O 0.16-0.70，Na₂MoO₄·2H₂O 0.15-0.45，ZnSO4·7H2O 0.30-0.80，添加量为培养基总体积的1/1000。