[发明专利]抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体及其制备

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种单克隆抗体，具体涉及一种抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体，以及该单克隆抗体的制备，本发明还涉及分泌该抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体的杂交瘤细胞株。 

背景技术

自美国学者Siegel等在1981年提出“红细胞免疫系统(Red cell immune system，RCIS)”概念以来，人们逐渐认识到红细胞不仅具有在血液中携带氧气的呼吸功能和调节血液pH值的缓冲功能，还具有免疫功能，并包含完整的自我调控系统。目前，人类医学领域中有关红细胞免疫的研究已经非常深入，红细胞在体内广泛参与特异性与非特异性免疫、机体免疫调控，并影响多种疾病的发生、发展，而CR1是人红细胞免疫功能最重要的物质基础。 

人CR1是一种存在于红细胞、淋巴细胞、白细胞表面的相对分子质量205kDa的单链糖蛋白，其在每个红细胞上的数量为950，以散在和集簇状态分布在细胞膜上。人红细胞上有50%的CR1呈集簇分布，而其他细胞上CR1的集簇分布率却小于15%，红细胞CR1的这种集簇分布方式可使它与C3b包被的免疫复合物的结合位点呈多价性，且连接更为牢固。由于血液循环中绝大多数的CR1存在于红细胞膜上，红细胞清除血液循环免疫复合物的几率比白细胞大500-1000倍，因此，以CR1基础的红细胞免疫黏附是人红细胞最重要的免疫功能。当人红细胞对免疫复合物的结合受到限制时，免疫复合物就会沉积在敏感组织中，导致许多疾病的发生。 

目前的研究证实，多种哺乳动物、啮齿类动物、禽类红细胞具有免疫粘附功能，但并未证实CR1是动物红细胞唯一的免疫粘附受体，也未见有特异性阻断这种免疫粘附的研究报告，更未从动物红细胞膜上获得过粘附受体并证明其蛋白质特性。猪作为我国饲养量最大的家畜和人类医学和生物医学工程领域最常用的模型动物，对猪红细胞CR1-like功能的研究，将有可能提高和改善猪养殖和疾病治疗的现状，并为其他动物红细胞免疫粘附的研究提供借鉴，也将为人类开展以CR1为靶点的疾病治疗和药物研发提供研究基础。 

由于对猪红细胞CR1-like研究缺乏有效的试验工具，特别是抗猪红细胞CR1-like的特异性抗体，使得猪红细胞CR1-like研究进展较为缓慢。因此，提供一种抗猪红细胞CR1-like的单克隆抗体，对进一步研究猪红细胞CR1-like具有重要意义。 

发明内容

本发明的目的是提供一种分泌特异性识别猪红细胞CR1-like的单克隆抗体的杂交瘤细胞株，以及上述杂交瘤细胞株分泌的抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体。 

本发明提供了一株抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体的杂交瘤细胞株，所述杂交瘤细胞株命名为CR-M01，于2014年6月6日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉市武昌珞珈武汉大学，邮编430072。保藏号为CCTCC NO:C201475。 

本发明所述的杂交瘤细胞株是通过杂交瘤技术，以合成的多肽作为免疫原建立的。 

本发明还提供了由所述杂交瘤细胞株CR-M01分泌的抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体，所述单克隆抗体的亚型为IgG1。 

所述单克隆抗体纯化后，经western blot和免疫荧光染色，证明其能够特异性识别猪红细胞CR1-like蛋白。 

进而，本发明所述抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体能够特异性的阻断猪红细胞的免疫粘附作用。 

本发明提供的抗猪红细胞CR1-like单克隆抗体的制备方法包括如下步骤： 

1 抗原制备

对GenBank登录的猪红细胞CR1-like基因进行分析，选取CDS区翻译出相应的蛋白质序列，分析蛋白质序列二级结构，获得以下抗原位点pep：NSFWSIPEGNCKRKT。将抗原位点合成多肽，多肽分别偶联KLH和BSA，其中KLH-pep用于小鼠免疫，BSA-pep用于ELISA后期筛选。

2 动物免疫 

以KLH-pep免疫Balb/c小鼠，ELISA检测血清效价大于10000的小鼠，融合前3天用免疫原50μg/只量腹腔注射待融合小鼠进行加强免疫。

3 杂交瘤细胞制备 

制备免疫脾细胞，与培养的骨髓瘤细胞进行冲击融合，采用HAT选择性培养基筛选出杂交瘤细胞，ELISA筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，克隆扩增冻存，同时对杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体进行亚型鉴定。

4 单克隆抗体制备