[发明专利]黑眶蟾蜍抗菌肽及其基因和应用

说明书

技术领域

本发明提供一种黑眶蟾蜍抗菌肽基因获取、合成及应用，属于生物医学技术领域。

背景技术

黑眶蟾蜍，无尾目，蟾蜍科，蟾蜍属，是传统蟾蜍类中药材（蟾酥、干蟾、蟾皮和蟾衣）的主要来源之一。近年，大量的研究表明蟾酥药理活性谱极广，具有抗肿瘤、强心、升压、兴奋呼吸、镇咳平喘、利尿、兴奋平滑肌、抗血小板聚集、抗炎、增强免疫力及局麻药等作用。20 世纪80 年代蟾酥应用于临床，用于治疗恶性肿瘤、各种感染性疾病、慢性肝炎、骨髓炎、周围性面神经麻痹、止痛麻醉等。目前对蟾蜍类药物活性成分的研究主要集中在小分子化合物上，主要发现的有蟾蜍甾烯、环氧蟾蜍内酯类、蟾毒色胺类（bufotenines）和甾醇类等。

有实验表明蟾酥对金黄色葡萄球菌和甲型溶血性链球菌感染的家兔，具有明显的治疗效果；且抑菌效果迅速，对一些抗生素不敏感或耐受的化脓性感染病原体亦有抑制效果，但其物质基础不甚清晰。2010年，研究人员对黑眶蟾蜍皮肤分泌物进行了初步的分离纯化，得到一种耐热、pH稳定和抗菌谱广的抗菌物质。该抗菌物质经胰蛋白酶水解后，抑菌活性完全丧失，说明该抑菌活性成分为蛋白多肽类物质。但该蛋白多肽成分的序列以及具体功能现今未明。发明人通过基因工程手段获得了黑眶蟾蜍抗菌肽的基因序列，并对其进行了多肽合成与性质研究。

发明人将本发明所述的黑眶蟾蜍抗菌肽氨基酸全序列及其编码基因分别对蛋白质数据库和基因数据库进行了比对搜索，均未发现有任何相同序列信息。

发明内容

本发明的目的在于提供一种黑眶蟾蜍抗菌肽，该黑眶蟾蜍抗菌肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示，其是一种单链多肽，分子量4161.268道尔顿，等电点11.11。

本发明另一目的是提供一种编码所述黑眶蟾蜍抗菌肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

黑眶蟾蜍抗菌肽基因的克隆方法如下:

黑眶蟾蜍皮肤总RNA提取、反转录及设计引物并利用PCR方法筛选黑眶蟾蜍抗菌肽基因，其中正向扩增引物长度为24个核苷酸，其序列如SEQ ID NO：3所示，反向扩增引物长度为23个核苷酸，其序列如SEQ ID NO：4所示；所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，基因测序结果表明编码黑眶蟾蜍抗菌肽的基因由495个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：

atgaggagct ggaggctgtc tctgctgctg gtctctgcag tcacattaca cggctgtctc60

tctgaccctg cagagcctga ggtccaagat ggaagatcta tagaagatgt catcgacctc 120

tacaaccaga gggagggggt cacatactta tataaatccc tggaccagct gccccctgtt 180

ccaatggagg aggatgagaa tccgaacaga agaggcttta tcatgaaaga gaccgtgtgc 240

ctcaaatccg agaatcctga tttaacccag tgtgatttca agcctgacgg agatgtgaag 300

atctgttctc tggatttggg ggatgaggat cctgaggata tcatgtgctt cagtctgaac 360

aaggaggtcc gtatgaagcg gtccagcaga aggaaaccat gcaaggggtg gctctgcaag 420

ctgaagctaa gaggaggtta tactcttatc ggcagtgcta caaacctaaa tagacctacc 480

tacgtgaggg cataa495

编码黑眶蟾蜍成熟抗菌肽为第382–492位核苷酸，其氨基酸序列为：

Ser Ser Arg Arg Lys Pro Cys Lys Gly Trp Leu Cys Lys Leu Lys Leu

1 5 1015

Arg Gly Gly Tyr Thr Leu Ile Gly Ser Ala Thr Asn Leu Asn Arg Pro

202530

Thr Tyr Val Arg Ala

35

黑眶蟾蜍抗菌肽的制备方法为多肽固相合成法，通过HPLC反相C18柱纯化。该抗菌肽具有强大的抗菌活性。

本发明另一目的是将黑眶蟾蜍抗菌肽应用在制备新型抗菌药物中。