[发明专利]用于蝴蝶兰内参基因的TUA片段序列

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体涉及用于蝴蝶兰内参基因的TUA片段序列。

背景技术

蝴蝶兰（Phalaenopsis spp.）又名蝶兰，花型优美，花色鲜艳，花序排列整齐，花期长达 3～5 个月，被誉为“洋兰皇后”，具有很高的观赏价值，也是很多地区年宵花的第一主打产品，在花卉产业中占据越来越重要的地位，随着生物技术在花卉育种中的广泛应用，蝴蝶兰的发育调控分子机理成为研究的热点，相关基因的表达分析是其分子调控机理研究的主要内容，实时定量PCR是基因定量表达分析研究的重要手段，实施实时定量PCR的关键是要有稳定表达的内参基因作为参考标准，内参基因的作用是使未知样本总RNA量标准化，减少样本之间的误差，以获得准确的数据（Suzuki等，2000，Biotechniques,2000, 29(2):332-7），目前常用的内参基因主要有18S 核糖体脱氧核糖核酸（18S rRNA）, 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH）、肌动蛋白基因（ACTIN）和微管蛋白基因（TUA和TUB）等，但有研究表明, 这些常用的内参基因在不同的植物、不同的细胞类型或不同生理状态下的表达并不是恒定不变的，在一定类型的细胞中或实验因素条件下可能是变化的(Andersen et a1．，2004，Cancer Research, 64：5245–5250；张艳君等，2007，生物化学与生物物理进展，34:546-550)。实时定量PCR技术的灵敏度高,要求内参基因更为稳定的表达，以满足试验的严谨性，保证数据的可靠性，盲目地选用内参基因，会因其自身表达的变化，导致实时定量PCR结果的准确性降低，甚至得到相反或错误的结论，在实时定量PCR中，选择表达稳定的内参基因是技术的核心。在运用实时定量PCR进行蝴蝶兰的基因定量分析研究中，仅有以肌动蛋白基因（ACTIN）作为内参基因的报道，在蝴蝶兰不同发育阶段及不同组织稳定表达的内参基因的研究更是空白。

发明内容

本发明的目的是获得用于蝴蝶兰内参基因的TUA片段序列，TUA片段序列见SEQ NO.1。本发明通过多序列比对设计简并引物，将利用简并引物进行PCR扩增获得的目的基因片段连接到T载体上进行测序，获得α-微管蛋白基因（TUA）片段序列，根据TUA片段序列设计荧光定量特异引物，经实时荧光定量PCR检测，确认TUA片段序列为可在蝴蝶兰不同发育阶段不同组织稳定表达的内参基因，其中简并引物序列如下所示:

TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT；

TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC；

特异引物序列如下所示：

RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC；

RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。

为实现本发明目的，首先根据已知的植物微管蛋白基因设计简并引物，以蝴蝶兰幼苗期叶片为植物材料，进行PCR扩增及测序，然后对测序结果进行序列分析及实时定量表达稳定性检测，得到在蝴蝶兰不同发育阶段及不同组织中稳定表达的TUA片段序列。其中，简并引物如下所示：

TUA-F: AACTTYGCCCGYGGTCAYT；

TUA-R: GGYTGGTAGTTGATRCCRCAC；

TUA片段序列的分析是将序列及其编码的氨基酸序列提交到蛋白数据库中检索确认；实时定量表达稳定性检测是根据获得的TUA片段序列设计实时荧光定量PCR的特异引物，特异引物序列如下：

RT-TUAF:AAGCCATTTACGACATCTGCC；

RT-TUAR:GTGGTCAAGGATGAAATTATCTGAG。

以蝴蝶兰不同发育阶段的根、叶片、茎、花葶、萼片、花瓣、唇瓣、子房、蕊柱等16种组织材料进行实时荧光定量PCR，依据溶解曲线及扩增产物的测序来确定引物的特异性，依据标准曲线获得的扩增效率、相关系数确定数据的有效性，由实时荧光定量PCR的荧光阈值变化分析基因表达的稳定性，16种组织中的循环阈值平均值为20.57～24.21；以凝胶电泳的形式显示TUA基因的表达情况，凝胶电泳条带亮度一致，确定TUA片段序列表达具有稳定性；以此TUA片段序列作为内参基因检测蝴蝶兰的MADS-box基因DtpsMADS2的表达特性，结果表明，DtpsMADS2在营养器官和生殖器官均有表达，表达量以盛花期花葶中最高，在花器官各轮结构中只有少量表达，此测定结果与已有的研究报道结果一致。

本发明目的通过下列步骤实现：