[发明专利]一种七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法

说明书

一、技术领域

本发明涉及一种荧光染料及其制备方法，具体地说是一种七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，属于双光子荧光生物成像领域。

二、背景技术

分子影像技术，包括计算机断层扫描、超声成像、单光子发射断层成像、核磁共振成像、正电子发射断层成像和光学分子成像，日益成为现代生物医学基础研究及临床诊断研究中的重要手段与方法。其中光学分子成像技术因其具有非电离、非接触、高灵敏度、高通量和低成本的优点而被广泛应用于生物医学研究中。其中最具有代表性的是荧光成像。

双光子荧光显微成像具有很多显著的优于单光子荧光显微成像的特点，比如红外激发，成像深度深，降低组织自发荧光干扰，避免荧光漂白和光致毒等。

香豆素衍生物被广泛应用于生物荧光成像信号系统，因其具有水溶性好，低细胞毒性，生物兼容性好，斯托克位移大等优点，。但是在双光子荧光领域还很少被报道。因此设计并合成香豆素衍生物的双光子荧光染料具有很好的应用前景。

三、发明内容

本发明旨在提供一种七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料及其制备方法，本发明香豆素衍生物双光子荧光染料具有大的双光子吸收截面，低的细胞毒性，可以用于双光子荧光生物成像。

本发明七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的结构通式如下：

其中R为CH₃O-或(CH₃)₂N-。

本发明七位取代的香豆素衍生物双光子荧光染料的制备方法如下：

(1)将3-碘苯酚10g(45mmol)溶于160ml无水乙腈中，冰浴条件下加入12.8g(134mmol)无水氯化镁，10min加完；随后加入25.3ml三乙胺，加完后再分批加入多聚甲醛5.47g(636mmol)，回流反应24h后加入1M HCl水溶液调节pH到5终止反应，反应结束后加入乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸钠干燥并除去溶剂，柱层析分离(洗脱液为石油醚)后得到中间体1；

(2)将5g(20mmol)中间体1、3.9g(24mmol)丙二酸二乙酯、0.2ml哌啶以及5滴冰乙酸加入50ml乙醇中，回流反应5h，反应结束后冷却到室温，有白色固体析出，抽滤并干燥后得到中间体2；

(3)将2g(6mmol)中间体2、7.2mmol化合物A、42mg(0.06mmol)PdCl₂(PPh₃)₂以及23mg(0.12mmol)CuI加入史莱克瓶中，在无水无氧条件下加入10ml三乙胺和30ml四氢呋喃，室温搅拌反应3h，反应结束后减压蒸馏除去溶剂，通过柱层析100-200目硅胶，洗脱液按体积比为乙酸乙酯：石油醚＝1:3，得到目标产物；

所述化合物A为对甲氧基苯乙炔或4-二甲基氨基苯乙炔。

本发明合成路线如下：

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

本发明制备的荧光染料合成简单而且得到了单晶结构，具有大的双光子吸收截面，可以被双光子激发产生荧光，低的细胞毒性，可以进入细胞，进行细胞成像。

四、附图说明

图1是实施例2制备的荧光染料2的单晶结构图。

图2是实施例1、2制备的荧光染料1和荧光染料2的双光子吸收截面图。1M荧光染料1和荧光染料2在DMSO中所测得的双光子吸收截面，荧光染料1和荧光染料2的荧光量子产率分别为0.644，0.082。

图3是本发明荧光染料1(图a)，荧光染料2(图b)在细胞培养24小时后的细胞存活率。从图3中可以看出，浓度为10μM时，细胞存活率还有90％左右，说明了本发明荧光染料1和荧光染料2对细胞无毒性作用，因此可以用来做细胞成像。

图4是本发明荧光染料的双光子荧光共聚焦成像照片，其中图a为CHO细胞明场；图b为荧光染料1(10μM)在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在740nm激发下，荧光发射收集范围440-480nm；图c为CHO细胞明场；图d为荧光染料2(10μM)在细胞培养30分钟后，用PBS缓冲液(pH7.4)冲洗3次，在双光子荧光共聚焦显微成像，在840nm激发下，荧光发射收集范围520-560nm。

五、具体实施方式

实施例1：

1、中间体1的合成