[发明专利]一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒，属于化学分析、生物分析领域。

背景技术

溶酶体(lysosomes)是真核细胞中的一种细胞器，pH值约为3.8～5.0，为单层膜包被的囊状结构，直径约为0.025～0.8微米，内含多种水解酶。溶酶体的基本功能是对生物大分子等物质的消化与清除，并在维持细胞的正常代谢活动及防御微生物的侵染方面扮演着重要的角色。因此，检测溶酶体pH值及其随环境因素的改变均具有重要的意义。目前市场上具备标记溶酶体功能的探针有：美国探针公司的LysoTracker Red DND-99(Abs：577nm；Em：590nm)，LysoTracker Deep Red(Abs：577nm；Em：590nm)等；同时具备标记溶酶体和比率测定溶酶体pH值功能的探针有：美国探针公司的LysoSensor^TM Yellow/Blue DND-160(PDMPO)(Abs：329nm、384nm；Em：440nm、540nm)，LysoSensor^TMYellow/Blue dextran(Abs：335nm、381nm；Em：452nm、521nm)等。这些探针存在诸如分析波长短，或不能进行比率测定等弊端。而同时具备标记溶酶体和比率测定溶酶体pH值功能的近红外探针尚未见报道。

半菁类染料具有良好的稳定性，被广泛应用于生物分析中；而基于半菁类染料衍生的可选择性标记与检测溶酶体pH值的比率型近红外荧光探针尚未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测pH值的荧光探针及其制备方法与专用检测试剂盒，该荧光探针为半菁类染料，可对水溶液的pH值进行检测，同时可标记溶酶体和比率测定溶酶体的pH值。

本发明提供了一种式Ⅰ所示化合物，

式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；

Y的结构式如式Ⅱ所示，

式Ⅰ所示化合物具体可为式Ⅲ所示化合物(Lyso-pH)，

本发明提供的化合物以半菁类近红外荧光团为母体，包含一个靶向溶酶体的吗啉基团。

本发明进一步提供了上述式Ⅰ所示化合物的制备方法，包括如下步骤：

(1)式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和吗啉经还原反应，得到式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇；

(2)惰性气氛下，在碱存在的条件下，式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇与式Ⅵ所示三碳菁类染料经取代分解重排反应，即得式Ⅰ所示化合物；

式Ⅵ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；

式Ⅰ

式Ⅰ中，X为碳原子数为1～6的烷基、磺酸基取代的碳原子数为1～6的烷基、磺酸钠基取代的碳原子数为1～6的烷基和磺酸钾基取代的碳原子数为1～6的烷基中的任一种；

Y的结构式如式Ⅱ所示：

上述制备方法，步骤(1)中，所述二羟基苯甲醛具体可为2,4-二羟基苯甲醛。

式Ⅳ所示二羟基苯甲醛和所述吗啉的摩尔比可为1～5：1，具体可为1：1。

所述还原反应在还原剂作用下进行；所述还原剂与式Ⅳ所示二羟基苯甲醛的摩尔比为1～5：1，具体可为1.2：1；

所述还原剂可为H₂、LiAlH₄和NaBH₄中任一种；

所述还原反应的反应温度可为0～50℃，具体可为25℃；反应时间可为10～200min，具体可为60min；

所述还原反应可在有机溶剂中进行；所述有机溶剂具体可为甲醇；

上述制备方法，步骤(2)中，所述碱与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比可为0.01～1：1，具体可为0.2：1；

所述碱为有机碱和无机碱中的至少一种；

所述有机碱可为三乙胺和吡啶中至少一种；所述无机碱可为碳酸钾、氢氧化钠、碳酸钠和碳酸氢钠中至少一种；

式Ⅵ所示三碳菁类染料与式Ⅴ所示取代吗啉甲基苯基二醇的摩尔比可为1：0.1～1，具体可为1：0.5；

式Ⅵ所示三碳菁类染料具体可为IR780碘化物，其结构式如式Ⅶ所示，