[发明专利]一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法

权利要求书

1.一种重组工程介导的苜蓿中华根瘤菌Rm1021基因敲除方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)通过重叠－延伸聚合酶链式反应扩增获得两侧为针对待敲除基因500bp同源片段、中间为卡那霉素抗性基因的融合DNA片段；

(2)融合DNA片段电转化至由异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导的、克隆在质粒pLS2406中的重组酶基因表达的Rm1021细胞中，在卡那霉素抗性筛选之下，卡那霉素抗性基因取代目的基因而获得基因敲除变株；

(3)将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pL2S406。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导重组酶表达的Rm1021细胞中，重组酶基因来源于λ噬菌体，通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导而表达；重组酶基因克隆在质粒pLS406上，pLS2406同时含有负筛选标记sacB基因。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述质粒pLS406通过以下步骤构建得到：以λ噬菌体DNA为模板，SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的序列为引物PCR扩增得到1.9kb的DNA片段，以SacI和XbaI酶切后，克隆至以同样酶切的pBluescript II KS(-)，经测序验证，得到重组克隆pNdRed；pNdRed以NdeI和XbaI酶切，分离1.9kb的DNA片段，与同样酶切的pSRKGm连接，固体培养基中加入25μg/ml庆大霉素，IPTG和X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)进行筛选；挑取白色的克隆提质粒酶切鉴定，得到重组克隆pLS2405；pKsacB以XbaI和BamHI酶切，分离1.8kb的sacB基因片段，与以同样酶切并经碱性磷酸酯酶处理的pLS2405相连，通过酶切鉴定获得重组克隆pLS2406。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于：将基因敲除变株在含0.4％蔗糖的固体培养基中培养以消除含重组酶基因的质粒pLS406。