[发明专利]快速检测HLA-B*1502等位基因的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及快速检测HLA-B*1502等位基因的引物、试剂盒及方法。

背景技术

癫痫是一种古老的神经系统常见病，严重危害着人类的健康。我国约有900多万癫痫患者，其中600万病人每年仍有发作，而且每年还会出现60万新发病例。卡马西平(CBZ)、苯妥英钠(PHT)、拉莫三嗪(LTG)、奥卡西平(OXC)和苯巴比妥(PB)是常见的芳香族抗癫痫药物(AEDs)。这些药物广泛应用于临床且能有效地控制癫痫发作与神经痛，但是同时他们也会导致皮肤型药物不良反应(cADRs)。

随着人类基因组学和药物基因组学研究的不断深入，一些药物所致严重皮肤反应与人类白细胞抗原HLA基因的关系得到了确认。HLA基因位于人体第6号染色体，是一群紧密连锁的复等位基因，包括100多个基因座位，已发现9000多个等位基因，全长3600kb，占人类整个基因组的1/3000。HLA是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统。在不同的种族或同一种族不同群体中的分布显示明显的特异性。

经过研究，抗癫痫药物引起的皮肤不良反应的基因相关性得到了逐步揭示，其中HLA-B*1502与CBZ-SJS/TEN的强相关性业已得到确认。因此，美国FDA已做出相关警告，建议服用卡马西平前进行HLA-B*1502基因分型检测。英国药品和健康产品管理局(MHRA)亦发布了相关使用警告。

目前检测HLA-B*1502的主要方法为PCR-SBT(基于测序分型的聚合酶链反应)、PCR-SSP(序列特异引物引导的聚合酶链反应)、PCR-SSO(序列特异性寡核苷酸探针杂交聚合酶链反应)和RT-PCR(荧光定量PCR反应)等检测方法。其中PCR-SBT方法是对HLA基因的B位点进行测序，进而确定HLA-B*1502高分辨率的方法，但其检测的步骤繁琐，费用昂贵并且周转时间较长(大于1天)，不适合对于用药安全性的快速指导。RT-PCR的检测方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵，而且需要制备标准品，对实验环境要求高。PCR-SSP方法是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩增，具有成本低，时间短的特性。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测HLA-B*1502的试剂盒，但目前市面上的试剂盒涵盖的基因型别较少，容易出现假阳性，远远不能满足对用药安全性的快速、简便、高特异性检测HLA-B*1502基因的需求。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的HLA数据库，考虑不同引物设计的位置、序列、涵盖的等位基因数量等因素，并应用单管多重PCR反应体系，通过两个反应即实现了基因型别的检测，从而提供了一种快速，简便、高特异性、易标准化地定性检测HLA-B*1502基因的PCR-SSP方法。

为此，本发明一方面提供了一种快速检测HLA-B*1502基因的引物，其包含SEQ ID NO.1-4所示的检测引物EPF01、EPR01、EPF02和EPR02，所述四种引物分别组成引物组P1和P2，其中P1组为EPF01-EPR01-EPF02-EPR02，P2组为EPF01-EPR02-EPF02-EPR01。

在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的内对照引物NCXF和NCXR。

本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*1502基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液中分别包含如上所述的引物组P1和P2，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中快速检测HLA-B*1502基因的引物EPF01、EPR01、EPF02和EPR02的浓度均为0.5μM。

在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上所述的内对照引物。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。

在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。