[发明专利]用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及用于KIR基因快速分型的引物、试剂盒及方法。

背景技术

杀伤细胞免疫球蛋白样受体(KIR)基因编码一族激活性和抑制性KIR受体，表达在NK细胞和部分T细胞表面，通过特异性识别靶细胞表面的MHC-I类分子，转导激活或抑制信号，从而调节NK细胞和T细胞的活性，在抗感染、肿瘤监测、移植免疫和自身免疫性疾病等方面发挥重要作用。KIR基因属于常染色体共显性遗传，位于人类染色体19q13.42，长约100～200kb，具有高度多态性。目前已明确的KIR基因共l6个，包括14个功能基因(KIR2DL1-5、KIR3DL1-3、KIR2DS1-5、KIR3DS1)和2个假基因(KIR2DP1、KIR3DP1)，形成以KIR3DL2和KIR3DL3基因分列染色体端粒端和着丝粒端，KIR2DL和KIR3DP1基因居中的框架格局，各KIR基因的规律组合又可形成KIR基因A和B两种单倍型。KIR基因的表达产物——KIR受体对NK细胞和部分T细胞活性调节起着重要作用，故检测KIR基因对感染、肿瘤和自身免疫病发病机制的探讨、发病预测、治疗及造血干细胞移植都具有临床指导意义。

1997年Uhrberg等首次建立了采用PCR-SSP方法检测KIR基因。随后又出现了序列特异性寡核苷酸探针聚合酶链反应(PCR-SSOP)、RT-PCR等检测方法。但这些方法都存在一定的局限性，主要表现在PCR-SSOP与RT-PCR方法需要特定的仪器，且试剂、耗材较贵。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测KIR的试剂盒，但因其采用的均是既往的引物，因而不能检测出近年来新发现的KIR基因的等位基因和座位，且其扩增产物多为长片段，对样本基因组DNA的要求也高，存在漏检和误检的可能，远远不能满足对KIR基因获得中高分辨率的分型结果的要求。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的KIR基因数据库，重新设计了KIR基因的PCR-SSP分型方法并建立了一套结果判读格局图。本发明的分型方法准确可行，与长片段扩增KIR基因的PCR-SSP分型法相比，其对KIR2DL1、KIR2DL2、KIR2DL3和KIR2DS1等基因均可获得中高分辨的分型结果。

为此，本发明一方面提供了一种用于KIR基因快速分型的引物，其包含SEQ ID NO.1-46所示的检测引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46，其中检测引物KP-01和KP-02组成一组，依次按照顺序两两组合，组成23组引物组。

在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQ ID NO.47和SEQ ID NO.48所示的内对照引物NCXF和NCXR。

本发明另一方面提供了一种用于KIR基因快速分型的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液分别包含如上所述的23组引物组，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中用于KIR基因快速分型的引物KP-01、KP-02、KP-03、……、KP-46的浓度均为0.5μM。

在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上所述的内对照引物。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。

在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。

本发明另一方面提供了一种对KIR基因进行快速分型的方法，其包含以下步骤：

1、提取待检测样品的DNA溶液；

2、采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒，以步骤1中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增；

3、PCR扩增产物经电泳后，进行结果判读，当电泳结果均出现与目标片段大小一致的条带时，表明该基因为KIR基因阳性，否则表明该基因为KIR基因阴性。

本发明再一方面提供了如上所述的引物或如上所述的试剂盒在KIR基因快速分型中的应用。