[发明专利]复制型重组人55型腺病毒载体及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)以Ad55基因组为模板，分别扩增基因组两端反向重复序列作为同源重组臂L和R，并连接至氨苄抗性载体，线性化后与人55型腺病毒基因组在大肠杆菌中同源重组，得到环化的基因组质粒A；

(2)以Ad55基因组为模板，扩增E3基因两端序列并反向连接至卡那抗性载体，线性化后与线性化的步骤(1)所述基因组质粒A重组，再经氨苄/卡那双抗筛选，得到去除E3基因的基因组质粒B；

(3)以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delK及R-delK；

L-delK以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到pVax-L-delK；R-delK以EcoRV+XbaI双酶切后连接至EcoRV+XbaI双酶切的pVax-L-delK得到敲除Kana基因的穿梭质粒pVax-delK(L+R)；

pVax-delK(L+R)质粒以SpeI+XbaI酶切，回收delK(L+R)片段；

pAd55ΔE3-Kana以SwaI线性化；delK(L+R)片段和线性化的pAd55ΔE3-Kana共转染感受态细胞，同源重组得到去除Kana基因的pAd55ΔE3质粒；

并整合入唯一酶切位点，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)为：

以Ad55基因组为模板，PCR得到Ad55基因组两端ITR区序列的重组臂L-arm及R-arm；

L-arm连接至T载体得到pT-L；R-arm以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的pT-L得到环化穿梭质粒pT-L+R；

pT-L+R以BamHI+EcoRI线性化后，与Ad55基因组共转化感受态细胞，得到pAd55质粒。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)为：

以Ad55基因组为模板，进行PCR扩增，得到E3区上下游同源重组臂L-delE3及R-delE3；

L-delE3以SpeI+EcoRI双酶切后连接至SpeI+EcoRI双酶切的pVax载体得到pVax-L-delE3；R-delE3以EcoRI+XbaI双酶切后连接至EcoRI+XbaI双酶切的pVax-L-delE3得到敲除E3基因的穿梭质粒pVax-delE3(L+R)；

pVax-delE3(L+R)以EcoRI线性化，pAd55以EcoRI经部分酶切线性化，共转化感受态细胞，涂至氨苄、卡那双抗性平板，提取阳性克隆继续转化感受态细胞，得到去除E3基因并在E3区引入唯一酶切位点SwaI的基因组质粒pAd55ΔE3-Kana。

4.一种复制型重组人55型腺病毒载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将Ad55基因的E3区两端序列连接至卡那抗性载体，并将外源基因表达框插入至E3区两端序列之间，得到携带外源基因表达框的穿梭质粒；

(2)如步骤(1)所述穿梭质粒线性化后，与线性化后的如权利要求1-3任一项所述的制备方法中步骤(3)所述pAd55ΔE3质粒同源重组，得到E3区缺失并整合外源序列的基因组质粒，线性化后转染哺乳动物细胞，密度梯度离心得到纯化的复制型重组人55型腺病毒载体。