[发明专利]快速检测HLA-B*27等位基因的引物、试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及快速检测HLA-B*27等位基因的引物、试剂盒及方法。

背景技术

HLA抗原是人类主要组织相容性复合体(Major Histocompatibility Complex,MHC)的表达产物，在免疫系统中主要负责细胞之间的相互识别和诱导免疫反应，具有调节免疫应答的功能。近年来研究HLA与疾病相关性的资料表明，某些疾病的发生率与一些特殊型别的HLA检出率有关，这些病人大多是发病机理不明并伴有免疫功能异常和有遗传倾向性的疾病，因此，分析HLA抗原表达情况不仅有助于了解发病机理，对于疾病的诊断、预防和预后判断都有重要意义。

HLA-B*27基因属于Ⅰ型MHC基因，基本上表达在机体中所有有核的细胞上，尤其是淋巴细胞的表面具有丰富的含量。早在二十多年前，人们就已发现HLA-B*27抗原的表达与强直性脊椎炎有高度相关性，超过90％的强直性脊椎炎患者其HLA-B*27抗原表达为阳性，普通人群中仅5-10％为阳性，而强直性脊椎炎由于症状与许多疾病相似而难以确诊，因此HLA-B*27的检测在病中的诊断中有着重要意义。在脊椎性关节病这一类的疾病中除了强直性脊椎炎以外，还有许多其它的疾病与HLA-B*27抗原的表达有着或多或少的相关性，因此HLA-B*27的检测在这些疾病的诊断中是一个非常有价值的指标。

目前HLA-B*27等位基因的检测方法主要有血清学分型、直接测序和引物特异性扩增等方法。血清学分型的方法由于抗体亲和力较弱、效价较低、易产生交叉反应严重影响了HLA分型结果的可靠性。直接测序的方法可以直接得到精确的序列信息，但是检测的步骤繁琐，费用昂贵，检测周期较长(大于1天)，不适合用于疾病辅助快速诊断的需要。PCR-SSP方法则是利用与HLA等位基因序列互补的引物，对待测样本DNA进行特异性PCR扩增，具有成本低，时间短的特性。虽然，总的来说PCR-SSP是一种相对简单方便、特异性高的方法，且目前已有基于PCR-SSP方法进行单特异引物检测HLA-B*27的试剂盒，但目前市面上的试剂盒涵盖的基因型别较少，许多新出现的HLA-B*27基因检测不出，远远不能满足对用药安全性的快速、简便、高特异性检测HLA-B*27基因的需求。

发明内容

本发明针对现有技术中存在的上述缺陷，基于最新的HLA数据库，考虑不同引物设计的位置、序列、涵盖的等位基因数量等因素，并应用单管多重PCR反应体系，通过一个反应即实现了基因型别的检测，从而提供了一种快速，简便、高特异性、易标准化地定性检测HLA-B*27基因的PCR-SSP方法。

为此，本发明一方面提供了一种快速检测HLA-B*27基因的引物，其包含SEQ ID NO.1-5所示的检测引物B27F01、B27R01、B27R02、B27R03和B27R04。

在本发明优选的实施方案中，该引物还进一步包含SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示的内对照引物NCXF和NCXR。

本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*27基因的试剂盒，其包含PCR反应混合液和Taq酶，所述PCR反应混合液包含如上所述的快速检测HLA-B*27基因的引物，所述Taq酶的浓度优选为5U/μL

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中快速检测HLA-B*27基因的引物B27F01、B27R01、B27R02、B27R03和B27R04的浓度均为0.5μM。

在本发明另一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含如上所述的内对照引物。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中内对照引物NCXF和NCXR的浓度均为0.2μM。

在本发明再一优选的实施方案中，该试剂盒的PCR反应混合液中进一步包含dNTPs，染料和PCR缓冲液，染料进一步优选为甲酚红。

在本发明更加优选的实施方案中，该试剂盒中dNTPs浓度为0.2mM，染料浓度为0.01％，PCR缓冲液组成为：Tris-HCL浓度10mM，氯化钾浓度50mM，氯化镁浓度1.5mM，明胶浓度0.001％。

本发明另一方面提供了一种快速检测HLA-B*27基因的方法，其包含以下步骤：

1、提取待检测样品的DNA溶液；

2、采用如上所述的引物或采用如上所述的试剂盒，以步骤1中提取的DNA溶液作为模板，进行PCR扩增；