[发明专利]一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于生物医学工程技术领域，具体涉及一种铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。

背景技术

纳米材料的特性使其在肿瘤诊断分析方面具有许多优势，纳米技术的近期发展使得纳米级载体可以同时连接上各种功能性分子，包括对肿瘤特异识别的配体、抗体、抗癌药物以及成像探针等。生物笼状蛋白本身就是天然生物大分子，具有良好的生物兼容性。他们通常是由多个多肽亚基结合形成中空结构，外部与中空直径均在纳米尺度，使得纳米材料易于在其表面、内部以及各蛋白亚基界面之间进行修饰，组装成各种多功能分子。近来随着基因工程、蛋白化学修饰技术与纳米技术的融合，这方面的工作已经引起了普遍的关注和兴趣。

有大量研究表明，肿瘤细胞的表皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)表达量过高，这使得EGFR成为肿瘤治疗中一个非常好的靶点。表面修饰EGF的纳米粒子，能通过配体受体结合作用进入细胞，这为药物的传递提供了良好的可行性。然而，现有的修饰了EGF的纳米粒子与细胞的结合作用并非很强。为了进一步提高靶向肿瘤细胞的能力，有必要研究开发在细胞穿透能力和细胞结合作用方面更强的新型纳米粒子。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有的纳米粒子对肿瘤细胞的靶向能力不够强，效率不够高的缺陷，而提供一种新的铁蛋白重链亚基纳米粒子及其制备方法和用途。本发明的铁蛋白重链亚基纳米粒子的N端修饰有具有不同由荷性质的短肽，与修饰有EGF的纳米粒子同时进行变复性，并在体外进行自组装，形成的杂合蛋白纳米粒子具有强的细胞穿透力，能够与肿瘤靶细胞有很强的结合，为后续选择药物靶向肿瘤细胞治疗提供了非常好的模型，具有很好的应用前景。

本发明提供下述技术方案解决上述技术问题。

本发明提供的技术方案之一是：一种铁蛋白重链亚基纳米粒子，其在FTH1的N端修饰有穿膜肽。

本发明中，所述的FTH1为本领域最常见的铁蛋白重链亚基纳米粒子(专利CN101942022A中已经对其做了详细披露)，其还可以是现有技术中已经报道过的任意的铁蛋白重链亚基纳米粒子。

本发明中，所述的穿膜肽(cell-penetrating pep tides，CPPs)为本领域常规所述的穿膜肽，其是一类具有特殊功能的多肽分子，一般由30个以下的氨基酸残基构成，具有生物膜穿透功能，还可携带其他分子甚至超分子颗粒进入细胞中。正是因为这种特殊的性质，它们被看作生物活性分子有效的细胞内转运工具，具有广泛的应用前景。

较佳地，所述的穿膜肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1，SEQ ID NO.2，SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4中的任一种所示。前述几种氨基酸序列均由短肽TAT(其氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示)通过点突变设计引物而扩增获得，其中，TAT是最先被发现并证实的具有穿膜功能的多肽分子，作为一种阳离子穿膜肽，其本身所含有的大量碱性氨基酸残基，在穿膜过程中同时起到了核定位信号的作用。

本发明提供的技术方案之二是：一种杂合蛋白纳米粒子，其由N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基纳米粒子和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基纳米粒子组成。

本发明中，所述的EGF(Epidermal Growth Factor)为本领域常规所述的含义，其为表皮生长因子，是哺乳动物体内的一种小肽，在体内体外都对多种组织细胞有强烈的促分裂作用。

本发明提供的技术方案之三是：如前所述的杂合蛋白纳米粒子的制备方法，其包括如下步骤：

(1)基因工程菌株的构建：分别构建表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白的基因工程菌株，其中，所用的表达载体为pET-28(+)，所用的宿主菌为大肠杆菌；

(2)融合蛋白的表达和收获：将步骤(1)所述的基因工程菌株接种于LB培养基上培养，加入IPTG诱导表达，然后破碎菌体，离心，分别收获表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白；

(3)杂合蛋白纳米粒子的自组装：将步骤(2)收获的表达N端修饰有穿膜肽的铁蛋白重链亚基融合蛋白和N端修饰有EGF的铁蛋白重链亚基融合蛋白在体外进行变性，然后置于透析液中进行梯度透析复性，收获自组装而得的杂合蛋白纳米粒子。