[发明专利]一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫学检测技术领域。

背景技术

百菌清是一种广谱有机氯杀菌剂，对各种农作物及各种绿化草坪等的真菌病害具有预防作用。百菌清没有内吸传导作用，但一但喷到植物体上之后，就能在其体表具有良好的黏着性，不易被雨水冲刷掉，因此药效期较长，再加上其广泛使用，因此，百菌清及其代谢产物在植物与土壤都有较大的残留，甚至在北极地区都有检测到。

目前检测百菌清的方法主要是气相色谱法(GC)，液相色谱法(HPLC)，分光光度法、导数同步荧光法、薄层层析-分光光度法、气质联用法等紫外仪器方法，但是这些方法存在操作繁琐，耗时，费用比较贵等缺点，不能实现大量样品的快速检测，因此建立一种快速简便的百菌清检测方法具有重要意义。酶联免疫法（ELISA）是一种极为高效、敏感、快速的检测方法，检测时对样本的纯度要求不高而且操作简便，适用于大量样本的现场快速检测。然而得到高特异性和高特异性的单克隆单体是免疫学检测的前提，其中人工抗原的合成是其中重要的一步。

发明内容

本发明的目的在于提供一株百菌清具有较好特异性和检测灵敏度的单克隆抗体杂交瘤细胞株及其应用，其对百菌清具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立百菌清的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9304。

所述的抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌的百菌清单克隆抗体，是通过抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号分泌产生百菌清单克隆抗体。

所述百菌清单克隆抗体的应用，将百菌清单克隆抗体应用于百菌清的ELISA添加回收试验，测得其回收率。

（1）半抗原的合成：称取百菌清原药500mg（1.9mmol），KOH 106.6mg（1.9mmol），6-氨基己酸262mg（2mmol），将这三种药物溶于20mL乙醇，60℃反应12h，再90℃反应12h；

将反应物旋转蒸发，再用20mL水溶解，用盐酸调pH至4-5，产生沉淀，将沉淀烘干即为百菌清半抗原CTNH；用液质连用技术进行鉴定与分析；

（2）偶联物CTNH-BSA的制备：称取步骤（1）制备的CTNH 35.8mg，EDC 56.9mg，NHS 35.6mg，用1mL无水DMF溶解(称为A液)，室温搅拌反应8h；称取BSA 112mg溶于20mL pH7.2的0.01mol/L PBS中（称为B液），在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物CTNH-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原，并通过紫外吸收扫描方法鉴定；

（3）小鼠的免疫：百菌清完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化后，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠；

第一次免疫用完全弗氏佐剂，之后都用不完全弗氏佐剂。首免与加强免之间间隔一个月，加强免之间间隔21天。最后一次用百菌清完全抗原（不含佐剂）冲击免疫；通过间接ELISA检测血清效价和抑制；

（4）细胞融合与细胞株建立：通过聚乙二醇（PEG4000）法将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞融合，通过HAT培养基培养，利用间接ELISA检测阳性细胞孔，并进一步利用间接竞争ELISA法测定阳性细胞孔的抑制效果，通过有限稀释法对有最好抑制的阳性细胞孔进行三次亚克隆，最终筛选获得杂交瘤细胞株D号；

5）杂交瘤细胞株性质的鉴定：通过ELISA法测定灵敏度和特异性。

本发明的有益效果：本发明获得的抗百菌清单克隆抗体细胞株D号，对百菌清有较好的检测灵敏度和特异性（IC₅₀值为1.5μg/L）；本发明提供的一种新的半抗原合成的思路，通过衍生得到半抗原，在用异原包被进行检测，得到灵敏度很好的单克隆抗体细胞株。

生物材料样品保藏：一株抗百菌清单克隆抗体杂交瘤细胞株D号，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9304，保藏曰期为2014年5月28日。

附图说明

图1是单克隆细胞株D号分泌的单克隆抗体的抑制标准曲线。

具体实施方式

本发明下面的实施例仅作为本发明内容的进一步说明，不能作为本发明的限定内容或范围。下面通过实施例对本发明作进一步说明。