[发明专利]一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵生产正丁醇的方法。

背景技术

目前，世界能源需求主要由化石燃料满足。然而，化石燃料资源枯竭一直是困扰人类社会可持续发展的一大重要因素，随着科技的发展，人类越来越依赖能源来开展生产生活活动，这种影响近年来尤为明显，对有限的能源资源的需求与日俱增，因此，开发一种新型能源势在必行。正丁醇作为一种新型能源载体，其与汽油互溶性好，并可直接应用于现有发动机，具有较高的能量密度，辛烷值接近汽油，且亲水性较差，便于运输等优点，被称为新一代生物能源。生产正丁醇的方法有很多种，石油加工法目前应用最广、成本也较低，但是其受制于石油资源的枯竭具有不可持续性；而生物发酵法生产正丁醇技术以其可持续性和发酵过程节能环保，受到广泛的关注。为了使生物发酵生产正丁醇更具经济竞争力，寻求一种可再生且廉价的基质是关键。木质纤维素原料，如农业废弃物，是地球上最廉价、最丰富的可再生资源之一。亚洲国家具有巨大的利用农业废弃物生物发酵生产正丁醇的潜力，仅我国每年农业废弃物(玉米秸秆、稻草和麦秸等)的产量可达7亿吨左右，能量相当于5亿吨标煤。如果能将这些生物质资源有效利用起来，有目的性地降解，并进一步转化为丁醇，这将极大的降低生产丁醇的成本，使大规模并产业化生产燃油丁醇成为可能，这将在一定程度上缓解当前紧张的能源短缺局面。

由于秸秆表层蜡质的保护作用、木质素和半纤维素的空间障碍效应以及纤维素的高结晶度和聚合度影响秸秆的生物转化效率。因此，要充分有效利用农作物秸秆资源，就必须对秸秆进行预处理，破坏秸秆的表层蜡质、木质素-半纤维素的共价结合、纤维素的结晶结构等，使纤维素与木质素及半纤维素相互分离，增加纤维素分子与微生物或酶的接触概率，实现提高秸秆生物转化效率的目的。生物酶法水解因其反应条件温和、酶促反应的特异性与高效性受到青睐。但是在生物酶法水解的过程中所用的纤维素商品酶制备过程复杂、保存条件严格、价格较高，会进一步提高生物发酵生产正丁醇的成本。

生物酶法降解木质纤维素是一个酶系各组分相互协同作用最后达到降解效果的过程：内切葡聚糖酶能够附着在纤维丝表面切断纤维素的分子链，外切葡聚糖酶则在纤维素分子链两端进行切割形成葡萄糖或纤维二糖，最后β-1,4-葡萄糖苷酶能够将纤维二糖分解形成葡萄糖。在这一过程中各种酶相互协调的效果取决于各组分的酶活力以及该组分在整体酶系中的比例。而由于不同菌种中纤维素酶系各组分表达的差异性，在纤维素酶系的生产过程中往往几种酶的活力及产量配比是无法协调发挥最大效率的。如常见的纤维素酶生产菌株绿色木霉，其纤维素酶系中β-1,4-葡萄糖苷酶活性较低，结果会造成在其纤维素水解产物中纤维二糖的大量积累，这不但会降低其纤维素的降解效率，更对接下来水解液的进一步发酵应用产生不利影响；再如另一常见纤维素降解真菌黑曲霉中，若仅仅β-1,4-葡萄糖苷酶具有较高酶活，但其内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶活力不足以降解纤维素产生足够的纤维二糖，对黑曲霉降解纤维素的整体效率没有帮助。因此多种菌株纤维素酶的混合粗酶液水解纤维素能够明显改善整体纤维素酶系中各组分酶的协调比例，最终提高整体的纤维素降解能力，有利于降低纤维素发酵生产正丁醇的生产成本。但目前没有一组有效的多种菌株有效生产正丁醇的方案。

发明内容

本发明要解决现有生物发酵生产正丁醇过程中底物成本高，木质纤维素水解过程中商品酶的应用造成成本上升，以及单一菌种纤维素酶系比例失衡造成的酶活降低等问题。从而提供一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法。

本发明的一种利用混合纤维素酶粗酶液水解木质纤维素发酵制备正丁醇的方法，是按以下步骤实现：

一、对木质纤维素采用碱预处理：木质纤维素与质量百分含量为2％的氢氧化钠溶液按质量比为1:9的比例混合，得混合溶液，将混合溶液在100℃条件下处理2h，然后将混合溶液经蒸馏水洗涤至pH为中性并在105℃条件下烘干至恒重，得到的残余固体即为预处理的木质纤维素；

二、混合粗酶液的获得：将绿色木霉和黑曲霉分别在好氧条件下采用液体发酵的方法获得绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液；然后将绿色木霉纤维素酶粗酶液和黑曲霉纤维素酶粗酶液按体积比为2～4:1的比例混合，得到混合纤维素酶粗酶液；