[发明专利]一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方

说明书

技术领域

本发明涉及生物学领域，特别涉及一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。

背景技术

体外受精技术是体外胚胎生产的重要环节，通过体外受精，能够生产大量优质廉价的胚胎，以满足胚胎商业化的需求。精子体外获能是体外受精技术必不可少的环节，精子获能时，精子内部发生着一系列的生理生化反应，包括精子表面精浆蛋白类物质的去除、离子在胞膜内外之间的运动(Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-和HCO₃^-内流而K⁺、Na⁺外流)、精子获能调控系统的开放、精子膜电位的超极化等。精子获能的分子机理主要有去能因子的失活、蛋白质酪氨酸的磷酸化、胆固醇的流失、活性氧的产生等。

表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶素中一种主要的酯型儿茶素，其分子量为：458.38，分子式：C₂₂H₁₈O₁₁。EGCG具有较强的抗氧化作用，能有效地清除氧自由基，能保护细胞及其DNA免受损伤，EGCG的这些特点，使得其在抗氧化、防治糖尿病、抗癌变和神经元保护功能等方面具有很强的功效。在精子体外获能过程中，精子会产生多种有害物质，如细胞脂肪代谢产生的活性氧、氧自由基，过量的活性氧和氧自由基将会大大降低精子体外荻能效果，进而影响体外受精效果。而EGCG具有很强的抗氧化作用，因此在体外胚胎生产培养体系中，添加一定浓度EGCG能有效地提高精子获能效果。

目前已建立了许多精子获能效果的评价方法，其中考马斯亮蓝染色法是一种常用的方法。考马斯亮蓝是一类蛋白质染色剂，未获能的精子顶体外膜中含有大量的糖蛋白，经染色后，精子头部顶端呈深蓝色，而获能后精子的顶体膜破裂，其中的糖蛋白被释放出来，因此，经过染色后，顶体区不着色。染色后在普通光学显微镜下可以观察到两种类型的精子：所有精子尾部均染成紫蓝色，头部则呈A型和B型。A型为没有发生顶体反应的精子，顶体区染成紫蓝色而顶体后区不染色或呈浅紫色，少量精子顶体后区也呈紫蓝色；B型为已发生顶体反应的精子，顶体区不染色或染浅紫色，其余部位染色与A型相似。考马斯亮蓝检查结果的稳定性和重复性好、各批次间的差异不大，可以在普通实验室中进行，能有效地评价精子获能效果。

在本发明之前，兔精液体外获能的研究较为成熟，但是在精子体外获能过程中，由于精子密度较大，精子自身代谢产生的氧自由基积累较多，因此有必要发明一种抗氧化型精子体外获能液用于提高精子获能效率，为后期胚胎生产奠定一定基础。

发明内容

本发明的目的就在于克服上述缺陷，研制建立一种适用于兔精子体外获能方法及培养液配方。

本发明的技术方案是：

一种适用于兔精子体外获能方法，其主要技术特征是在BO获能液中添加10μmol/L EGCG，用于精子体外获能处理。

本发明的另一技术方案是：

一种用于兔精子体外获能的获能液，其主要技术特征在于，是在BO获能液中添加10μmol/L EGCG，BO获能液配方为：NaCl 6.5453mg/mL，KCl 0.2997mg/mL，NaH₂PO₄·H₂O 0.1145mg/mL，MgCl₂·6H₂O 0.1057mg/mL，CaCl₂·2H₂O 0.330mg/mL，葡萄糖2.518mg/mL，0.2％酚红4％，100IU/mL青霉素，100IU/mL链霉素，NaHCO₃3.1080mg/mL，丙酮酸钠0.1380mg/mL，肝素20μg/mL，BSA20mg/mL。